This study was conducted to investigate the developmental ability of caprine embryos after somatic cell interspecies nuclear transfer. Donor cells were obtained from an ear-skin biopsy of a caprine, digested with 0.25% trypsin-EDTA in PBS, and primary fibroblast cultures were established in TCM-199 with 10% FBS. After maturation, expanded cumulus cells were removed by vigorous pipetting in the presence of 0.3% hyaluronidase. The matured oocytes were dipped in D-PBS plus 10% FBS＋7.5 ㎍/ml cytochalasin B and 0.05 M sucrose. The reconstructed oocytes were electrically fused with donor cells in 0.3 M mannitol fusion medium. After the electofusion, embryos were activated by electric stimulation. Interspecies nuclear transfer embryos with bovine cytoplasts were cultured in TCM-199 medium supplemented with 10% FBS including bovine oviduct epithelial cells for 7∼9 day. On the other hand, the NT embryos with porcine cytoplasts were cultured in NCSU-23 medium supplemented with 10% FBS for 6∼8 day at 39℃, 5% CO₂ in air. In caprine-bovine NT embryos, the cleavage(2-cell) rate was 36.8% in confluence and 43.8% in serum starvation. The developmental rate of morula- and blastocyst-stage embryos was 0.0% in confluence and 18.8% in serum starvation. In caprine-porcine NT embryos, the cleavage(2-cell) rate was 76.7% in confluence and 66.7% in serum starvation. The developmental rate of morula and blastocyst stage embryos was 3.3% in confluence and 3.0% in serum starvation, and no significant difference was observed in synchronization treatment between donor cells. In caprine-bovine NT embryos, the cleavage(2-cell) rate of cultured donor cells was 30.8% and 17.6% in 5∼9 and 10∼14 passage(P＜0.05). The developmental rate of morula and blastocyst stage embryos were significantly higher(P＜0.05) in 5∼9 passage(23.1%) than in 10∼14 passage(0.0%) of cultured donor cells. In caprine-porcine NT embryos, the cleavage rate was significantly higher(P＜0.05) in 5∼9 passage(86.7%) than in 10∼14 passage(50.0%) of cultured donor cells. The developmental rate of morula and blastocyst stage embryos were 3.3 and 0.0% in 5∼9 and 10∼14와 passage of cultured donor cells. In caprine-bovine NT embryos, the developmental rate of morula and blastocyst stage embryos were 22.6% in interspecies nuclear transfer, 33.9% in in vitro fertilization and 28.1% in parthenotes, which was no significant differed. The developmental rate of morula and blastocyst stage embryos with caprine-porcine NT embryos were lower(P＜0.05) in interspecies nuclear transfer(5.1%) than in vitro fertiltzation(26.9%) and parthenotes(37.4%).

본 연구는 체세포의 종류, 세포 제공 개체, 계대배양 수 및 세포의 trypsin 처리시간이 소 체세포 핵이식란의 체외발육에 미치는 영향을 검토하였다. 세 종류의 체세포(피부, 근육 및 난구세포) 와 암소 3 개체를 실험에 공시하였으며, 한 개체 유래의 피부세포는 5∼30회 계대배양하였고, 핵이식 전에 1∼3분간 trypsin처리하여 핵이식에 사용하였다. 핵이식과정은 상법에 따라 전기융합법을 이용하였다. 핵이식란의 배반포 발육율은 세포의 종류(16.5∼23.9%)나 개체 간(16.4∼19.5%)에 차이가 없으나, 30회 계대 배양한 세포를 사용한 경우(5.8%)에는 5회(25.3%) 또는 15회(23.5%) 계대 배양한 세포를 사용한 경우에 비해 유의적으로 낮았다(P＜0.05). 또한, 1분간 trypsinization 한 세포를 사용한 경우(30.7%)는 3분간 trypsinization 한 경우에 비해 배반포 발육율이 유의적으로 높게 나타났다(P＜0.05). 본 연구의 결과는 소 체세포 핵이식란의 발육이 체세포의 종류 및 세포 제공 개체에 따라서는 영향을 받지 않으나, passage 수 및 체세포의 trypsinization 시간에 따라서는 영향을 받을 수 있음을 시사한다.

복제수정란 생산에 있어서 수핵란 내 체세포 주입 후 전기적인 융합은 필수과정인데, 이 과정을 거치는 동안 많은 수의 체세포 주입 난자가 융합에 실패하거나 lysis가 일어나게 된다. 본 실험에서는 한우 체세포를 이용하여 핵이식을 실시한 후 수핵세포질과 응합을 시도할 때 전기융합 방법에 따른 융합율과 배발달율을 검토하고자 실시하였다. 공여세포는 한우 귀 세포조직을 채취하여 0.05% trypsin과 EDTA가 첨가된 D-PBS로 세포를 분리한 후 DMEM

본 연구는 난자의 성숙시간, PHA-P 처리 또는 활성화 방법이 소 미수정란의 탈핵, 재구축란의 융합, 활성화 또는 체외발육에 미치는 영향을 검토하였다. 미수정란은 성숙 후 16∼24시간에 탈핵을 실시하고, PHA-P 처리 또는 무처리된 귀 피부세포를 이식 후 전기융합을 실시하였다. 후자의 경우는 융합 전에 PHA-P로 15분간 배양하였다. 융합란은 A23187과 CHXM 혹은 DMAP의 병용처리에 의해 활성화를 유기하고, 7∼9일간 체외배양하였다. 탈핵율은 성숙 후 16∼18시간에 실시한 경우(70.2∼92.3%)가 성숙 후 20∼24시간(44.3∼3.4%)에 비하여 유의적으로 높았다(P<0.05). M-II기 염색체의 위치는 성숙배양 시간이 길어짐에 따라 제 1 극체와의 간격이 멀어졌다. Donor 세포 혹은 재구축란에 PHA-P를 처리한 경우는 무처리구에 비하여 융합율이 향상되었다(P<0.05). 핵이식배의 분할율 및 배반포 발달율은 A23187+DMAP 처리구에서 78.6%와 32.9%로, A23187+CHXM 처리구에 비하여 유의적으로 높았다(P<0.05). 본 실험 결과는 성숙후 18시간에 탈핵을 실시하는 것이 효과적이며, donor세포 또는 융합 전 재구축란의 PHA-P 처리가 융합율 향상시킬 수 있고, 또한, 융합란을 A23187과 DMAP으로 병용처리 함으로써 난자의 활성화 및 배반포 발육율을 향상시켜, 결과적으로 핵이식기술의 효율성을 증진시킬 수 있을 것으로 사료된다.

한우 태아 섬유아세포 유래 체세포복제수정란 이식으로 임신된 수란우가 분만예정일이 도래하였으나 분만징후가 없어 수정란이식 후 272일째에 dexamethasone 20 mg을 근육주사하고 24시간후 PG 25 mg과 estradiol 20 mg을 근육주사하여 분만유도를 실시하였다. dexamethasone 투여후 48시간만 분만징후를 나타내었으며, dexamethasone 투여후 50시간째에 40 kg의 수송아지를 견인에 의해 정상적으로 분만시켰다. 그러

칡소의 귀세포를 이용한 핵이식 시에 전기 융합조건이 핵이식란의 발생에 미치는 영향을 알아보고, 칡소의 귀세포와 한우의 태아섬유아세포를 이용한 핵이식란을 이식하여 수태율을 비교하였다. 전기자극 조건에 따른 핵이식 후 융합율은 51∼68%의 범위로 차이는 없었으나, lysis 율은 1.9kv/cm의 10us, 20us에서 각각 0.0과 38.7%, 2.0kv/cm의 10us, 20us에서 각각 2.9와 37.5%, 2.1kv/cm의 10us, 20us에서 각각 21.2와 51.8%을 보였다. 난할율은 1.9kv/cm의 10us, 20us에서 각각 75.8과 69.8%, 2.0kv/cm의 10us, 20us에서 각각 76.9와 68.8%, 2.1kv/cm의 10us, 20us에서 각각 70.5와 68.5로 큰 차이가 없었다. 그러나 배반포 발생율은 1.9kv/cm의 10us, 20us 각각 19.5와 48.6%, 2.0kv/cm의 10us, 20us에서 각각 20.0과 40.9%, 2.1kv/cm의 10us, 20us에서 각각 44.2와 27.0%로 각 조건에서 시간에 따른 차이를 보였다. 핵이식에서 공여세포와 세포질간의 융합율과 lysis율은 전압과 통전시간에 영향을 받으며 전압을 높이는 것이 통전시간을 길게 하는 경우보다 수핵난자의 세포질에 상해를 줄이고 배반포 발생에 유리 하였다. 한우의 태아섬유아세포의 핵이식후 생산된 배반포를 5마리의 수란우에 이식한 결과 두 마리가 임신되었고(40.0%), 칡소의 귀 세포를 핵이식한 후 생산된 배반포를 19마리에 이식한 결과 3마리가 임신되었다(15.8%).

본 연구는 체세포 및 체세포 핵이식란의 염색체 이상에 체세포의 계대의 영향성을 조사하고자 하였다. 한우 성축의 귀 조직으로 얻어진 세포를 공여세포를 체외성숙 후 제핵된 난자에 핵이식을 실시하였으며, 1.9kv/cm, 20/2times의 전기자극으로 융합후 5/ml의 ionomycin에서 4min, 1.9mM 6-DMAP에서 4h동안 배양함으로써 활성화를 유도하였다. 핵이식란은 CRlaa에서 4일간 배양 후 8 -cell단계에서 중기상의 유도를 위하여 상기 배양액 1ml당 0.05 colcemid에서 6-8시간 더 배양하였다. 이후, 6% Fetal bovine serum이 함유된 1% sodium citrate용액에 20분간 저장처리 후, methanol 5 : aceticacid 1 : distilled water 4로 1차, methanol 3: aceticacid 1 로 조성된 2차, methanol 4 : acetic acid 3 : distilled water 1의 3차고정액으로 1분간 재 침지시켰다. 고정 처리가 완료된 slide는 4% Giemsa용액으로 염색한 후 광학현미경 하에서 핵형 양상을 검경하였다. 체세포의 5계대에서는 684개의 spreads를 검경한 결과 염색체 수는 72%가 정상으로 60개이었고, 24%가 60개 이하였으며 4%가 60개 이상을 보였다. 10계대도 5계대와 비슷하여 71%가 정상, 26%가 60개 이하, 3%가 60개 이상이었고, 15계대에서는 55%가 정상이었고, 30%가 60개이하, 15%가 60개 이상을 보였다. 10계대 까지는 mixoploid의 비율의 변화가 없었으나 15계대에서 현저하게 늘어남을 볼 수 있었다. 또한 체외수정란과 핵이식란의 비교에서는 체외수정란은 250개의 spreads를 검경한 결과 염색체 수는 95.6%가 정상으로 60개이었고, 2.0%가 60개 이하, 2.4%가 60개 이상이었으나, 핵이식란은 204개를 검경하여 88%가 정상이었고, 4.9%가 60개이하, 7.1%가 60개 이상을 보임으로써, 핵이식란이 체외수정란에 비하여 염색체 이상의 비율이 높았다. 따라서 계대에 따라 체세포의 염색체이상의 비율이 상대적으로 증가하고, 체세포 핵이식에 따른 염색체 이상이 생길 수 있음을 알 수 있었다. (이 논문은 농림부 연구비에 의해 수행되었음)

본 연구는 복제 돼지의 생산성 향상과 형질전환에 의한 대체상기용 복제 돼지 생산에 기여하기위한 기초연구로 공여세포의 조건, 핵이식 수정란의 융합 및 활성화와 체외발달에 미치는 각종 요인들은 조사하였다. 공여세포는 생후 10개월 된 Landrace 종으로부터 귀 세포조직(55mm)을 채취하여 0.05%의 trypsin과 EDTA가 첨가된 D-PBS로 세포를 분리하여 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액으로 계대배양을 실시하여 사용하였다. 핵이식은