본 연구는 혈통이 확인된 한우 암소의 체중과 월령에 따라 난소에서 난포의 분포 양상을 확인하고, 체외성숙배양 배지가 채취된 미성숙 난자/난구세포의 배양시 분할율에 미치는 영향을 확인하고자 수행하였다. 도축장에서 도축된 암소들의 혈통, 생체중, 및 월령을 기준으로 적출된 난소를 분류한 후, 난소 모양, 황체, 백체 및 난포액 분포 양상을 확인하였고, 개체별 한우 난소에서 18G 주사침이 장착된 5ml 주사기를 이용하여 난자를 채취한 후, 실체현미경으로 관찰하여 난구세포가 난자주변을 둘러싸고 있는 난자를 회수 하였다. 회수한 미성숙난자를 25mM HEPES 와 10% FBS 가 첨가된 TCM-199 으로 옮겨 2~3 회 세정한 후, follicle stimulating hormone(FSH, Sigma) 0.5 μg/ml, luteinizing hormone(LH, Sigma) 0.5μg/ml, β-estradiol(Sigma)1μg/ml 가 첨가된 미성숙 난자의 체외성숙배지 BO, TCM199, 및 IVMD101 를 각각 사용하여 22 시간 동안 38.5℃, 5% CO2 배양기에서 성숙시켰다. 동결정액은 동일한 보증씨수소 정액을 37.5℃에서 30 초간 융해 하였으며, 최종 정자에는 IVF100 을 첨가하여 각각의 정자 droplet 에 난자들을 38.5℃, 5% CO2 조건의 배양기에 5~6 시간동안 체외수정 하였다. 연구 결과, 무혈통 번식 한우의 체외성숙 배지별 분할율은 BO 배양액에서 23.99%였고, TCM199 에서 47.99%, IVMD101 에서 40.04%로, BO 가 가장 낮았고 TCM199 가 높은 경향을 나타냈다. 개체별 체중에 따른 난자의 체외성숙 배지별 분할율은 480kg 미만의 경우, TCM199 에서 72.73%였고, IVMD101 에서 33.77%로 TCM199 이 월등히 높았다. 480-639kg 의 경우, TCM199 에서 50.05%였고, IVMD101 에서 55.11%로 IVMD101 가 높았으나 비슷한 양상을 나타냈다. 640-699kg 의 경우는 TCM199 에서 65.38 %였고, IVMD101 에서 47.92%로 TCM199 가 높았으며, 700kg 이상의 경우에는 TCM199 에서 61.75%, IVMD101 에서 55.63%로 TCM199 가 더 높게 나타났다. 개체별 월령에 따른 난자의 체외성숙 배지별 분할율은 39 개월 미만의 경우, TCM199 에서 62.41%, IVMD101에서 50.00%로 TCM199 이 높았고, 39-50 개월미만의 경우에는 TCM199 에서 51.22%, IVMD101 에서 49.89%로 TCM199 이 더 높은 경향을 보였다. 50 개월 이상의 경우에는 IVMD101 에서 57.40%로 TCM199 에서 52.25%보다 높게 나타났다. 결과적으로 체중별로 채취된 난자는 TCM199 에서 분할율이 높았으며, 월령별로 채취된 난자는 50 개월이상의 경우 IVMD101 에서 분할율이 높았으나 39-50 개월미만과 39 개월미만의 경우 TCM199 에서 분할율이 높아 다른 경향을 보였다. 본 연구결과를 바탕으로 체중, 월령 및 배양 배지에 따라서 분할율의 향상과 이때 발현되는 번식형질 유전자의 발현에 관한 연구가 필요할 것으로 사료된다.

Hyaluronan은 난포액, 나팔관과 자궁에 존재하는 물질로 돼지의 다정자 수정을 억제하고 체외배 양액에 첨가시 배 발육을 향상시키는 것으로 알려져 있다. Glucuronic acid와 N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc)은 이중결합하여 hyaluronan을 구성하는 물질이다. 본 연구에서는 체외성숙 배양액 내 Glucuronic acid 및 GlcNAc 첨가가 돼지 난자의 성숙 및 단위발생 난자의 배 발육에 미치는 영향 을 조사하였다. 난자의 체외성숙 배양액으로는 0.1% PVA (polyvinyl alcohol)가 첨가된 Medium-199 을 기본배양액으로 이용하였고, 여기에 cysteine, pyruvate, epidermal growth factor, kanamycin, insulin 및 호르몬을 추가하여 44시간 동안 난자를 배양하여 체외성숙을 유도하였다. 실험설계에 따라 glucuronic acid 및 GlcNAc를 각각 0, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1 mM의 농도로 체외성숙 배양액에 첨가 하였다. 체외성숙된 난자는 전기자극을 통해 단위발생을 유도하였고 porcine zygote medium-3에서 7일간 체외 배양하였다. 실험 결과 난자의 체외성숙 배양액 내 glucuronic acid 첨가는 난자의 핵 성숙률(91.3-94.4%), 단위발생 후 분할률(85.5-93.6%) 및 배반포 발달율(42.0-51.0%)에 영향을 미치지 않았으나 배반포 세포수는 0.05 mM glucuronic acid 첨가 군에서 38.0개로 대조군의 31.5개에 비해 유의적으로(P<0.05) 증가하였다. 난자의 체외 성숙 배양액에 GlcNAc를 첨가하였을 때 난자의 핵 성숙률(94.3-97.2%) 및 단위발생 후 배반포 세포수(40.0-43.1)는 대조군 및 첨가 농도의 차이에 따라 유의적인 차이를 보이지 않았으나 분할률은 0.05 mM 처리군에서 91.8%로 대조군(85.0%) 및 0.005 mM 처리군(84.6%)에 비해 유의적(P<0.05)으로 증가하였다. 또한 0.05 mM 처리군의 배반포 발달 율은 59.6%로 대조군(46.3%), 0.005 mM 처리군(44.3%) 및 0.1 mM 처리군(45.2%)에 비해 유의적으 로 높았다. 이상 결과로 보아 체외성숙 배야액 내 0.05 mM glucuronic acid 및 GlcNAc 첨가는 돼 지 난자의 단위발생 후 배 발육을 증가시키는 것으로 사료된다.

Monosodium glutamate (MSG)는 아미노산의 일종인 글루탐산에 나트륨이 결합된 것으로 구수한 맛, 감칠맛을 내는 인공조미료로 사용되고 있다. 이전 연구에 의하면 쥐에서MSG의 섭취가 난모세 포의 발달에 유해하다는 결과가 보고되었다. 본 연구에서는 돼지 난자의 체외성숙 및 체외 배양액 에 MSG 첨가가 난자의 성숙 및 배 발육에 미치는 영향을 검토하였다. 난자의 체외성숙배양액으 로는 10% 돼지 난포액이 첨가된 Medium-199 (positivecontrol) 또는 비필수아미노산이 제거된 Porcine zygote medium (PZM)-4를 기본배양액으로 하여 여기에 cysteine, pyruvate, epidermal growth factor, kanamycin, insulin 및 호르몬을 첨가하여 사용하였다. 실험설계에 따라 MSG를 각각 0, 0.1, 1, 10 mM 농도로 체외성숙 배양액에 첨가하였다. 체외성숙 난자는 전기자극을 통해 단위발생을 유도하였고 PZM-3배양액에서 7일간 체외 배양하였다. 체외배양에서의 MSG 효과를 알아보기 위하 여 돼지 난포액 첨가 Medium-199에서 체외성숙된 난자들 중 제1극체가 방출된 난자만을 선별하여 단위발생 유도 후 PZM-3 (positive control) 또는 비필수아미노산이 제거된 PZM-4에 0,0.1, 1, 10 mM의 MSG를 첨가하여 배 발육에 미치는 영향을 조사하였다. 체외성숙 단계에서 MSG 효과를 조 사한 결과 MSG 농도에 따른 체외성숙률(61.3-70.3%)에는 차이를 보이지 않았지만 10 mM의 MSG 처리군(83.5%)이 0.1 mM 처리군(93.7%)에 비해 유의적으로 낮은 분할률을 보였다. 또한 MSG 처리 군들이 (14.5-25.5%) 무처리군(30.0%)에 비해 낮은(P<0.05) 배반포 발달률을 보였다. 체외배양 단계 에서 MSG 효과를 조사한 결과 10mM MSG 처리군(90.8%)이 1 mM 처리군(96.5%)에 비해 유의적 으로 낮은 분할률을 보였으며, 10 mM 처리군(32.8%)이 0.1과 1 mM MSG 처리군에(55.1, 51.4%)에 비해 유의적으로(P<0.05) 낮은 배반포 발달률 보였으나 무처리 대조군(46.6%)과 유의적 차이는 없 었다. 이러한 결과를 보아 체외성숙 배양액 내 MSG 첨가는 난자의 핵 성숙률에는 영향을 주지 않지만 고농도의 MSG 처리는 단위발생 후 분할률을 억제하며 배반포 발육능을 억제하는 것으로 확인되었다.

돼지 난자의 체외배양 과정에서 배양액의 삼투압의 차이 및 glycine과 alanine 단독 또는 병행 첨 가가 단위발생 및 체세포 핵이식 난자의 배 발육에 미치는 영향을 검토하였다. 난자 의 체외성숙 에는 10% 돼지 난포액, cysteine, pyruvate, epidermal growth factor, kanamycin, insulin이 첨가된 TCM-199을 이용하였다. 체외성숙 42∼44시간 후 제1극체가 방출된 난자만을 선별하여 단위발생 및 체세포 핵이식 난자를 생산한 후 modified porcine zygote medium (mPZM)-3 배양액에서 7일간 배양하였다. 실험 설계에 따라 체외배양 7일 또는 체외배양 초기 48시간 동안 280 또는 320 mOsm의 삼투압에서 난자를 배양하였다. 실험1에서 체외배양 7일 동안 280 또는 320 mOsm의 배 양액 내 glycine 또는 alanine 첨가 효과를 검토한 결과 삼투압 차이에 따른 분할률 및 배반포 발달 률에는 차이를 보이지 않았으나 320 mOsm에서 배양된 난자 및 280 mOsm에 glycine을 첨가한 군 은 280 mOsm에서 배양된 난자에 비해 높은 배반포 세포수를 보였다 (36.5-38.0 vs. 31.1, P<0.05). 실험2에서는 체외배양 초기 48시간 동안 280 또는 320 mOsm의 삼투압에서 배양하였고, 그 후 280 mOsm 배양액으로 옮겨 5일간 추가로 배양하였다. 또한 체외배양액 내 4.1 mM glycine 첨가가 배 발육에 미치는 효과를 검토하였다. 단위발생 난자를 배양초기 48시간 동안 320 mOsm에서 glycine이 첨가된 배양액에서 배양한 군이 280 mOsm에서 배양한 군에 비해 유의적으로 높은 배반 포 발달율을 보였다(36.5-50.4% vs. 25.9-27.9%, P<0.05). 또한 배양 초기 48시간 동안 320 mOsm 배 양액에 glycine을 첨가하여 배양한 난자 (50.4%)가 다른 처리군의 난자(25.9-36.5%)에 비해 유의적 으로 높은 배반포 발달율을 보였다(P<0.05). 실험3에서는 실험2와 동일한 실험설계로 체세포 핵이 식으로 작성된 배반 포의 inner cell mass (ICM)와 trophectoderm (TE) 세포수를 조사하였다. 실험결과 초기 46시간 동안 glycine이 첨가된 320 mOsm 처리군에서 배양된 난자의 ICM 비율이(26.0%) 280 mOsm 삼투압에 glycine을 첨가한 군(17.8%)에 비해 유의적(P<0.05)으로 증가하였다. 본 연구결과 단위 생식 및 체세포 핵이식 난자의 체외배양에서 glycine의 첨가 및 체외 배양초기 48시간 동안 320 mOsm 삼투압 처리는 배 발육과 배반포 세포수를 증가시키는 것으로 확인되었다.

Recent 2 decades, including in vitro maturation (IVM), assisted reproductive technologies (ARTs) achieved noteworthy development. However the efficiency of ARTs with in vitro matured oocytes is still lower than that with in vivo oocytes. To overcome those limitations, many researchers attempted to adapt co-culture system during IVM and consequently maturation efficiency has been increased. The beneficial effects of applying co-culture system is contemplated base on communication and interaction between various somatic cells and oocytes, achievement of paracrine factors, and spatial effects of extracellular matrix (ECM) from somatic cell surface. The understanding of co-culture system can provide some information to narrow the gap between in vitro and in vivo. Here we will review current studies about issues for understanding cu-culture system with various somatic cells to improve in vitro maturation microenvironment and provide bird view and strategies for further studies.

This study was conducted to examine the effect of oocyte donor age and micromanipulation medium on the development of mouse cloned embryos receiving cumulus cells. Mouse oocytes were obtained from 6 to 11 week-old mice BDF1 female mice(experiment 1) and cumulus cells were used as donor cells. Micromanipulation procedures for nuclear transfer(NT) were performed in FHM, M2 or Hepes-buffered TCM199(TCM199) medium(experiment 2). After nuclear transfer, the reconstructed oocytes were activated by 10 mM SrCl2 in Ca-free CZB medium in the presence of 5 μg/ml cytochalasin B for 5 h and cultured in KSOM medium for 4 days. In experiment 1, the survival rate of oocytes after injection of cumulus cells were significantly(p<0.05) lower in oocytes from 6～7 week-old mice(53.3%) than in oocytes from 8～9(80.9%) and 10～11 week-old mice(77.1%). In experiment 2, the survival rate of oocytes after cell injection were significantly(p<0.05) higher in FHM and M2 medium(71.7% and 76.9%) than in TCM199 medium (51.2%). The activation rates of cloned embryos were not different among the micromanipulation media. However, the embryos developed to blastocyst stage were significantly(p<0.05) higher in FHM medium(13.9%) than in M2 and TCM199 medium(0.0% and 0.0%). In conclusion, the present study suggest that oocytes from above 8 week-old mice are superior to oocytes from 6～7 week-old mice as a source of recipient cytoplasm and FHM is superior to M2 and TCM199 as a micromanipulation medium for mouse somatic cell cloning.

The objective of this study was to evaluate the effects of co-culture of bovine oocytes with cumulus cells on in vitro maturation and development following in vitro fertilization in bovine oocytes. Bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) and denuded oocytes (DO) were co-cultured with the cumulus cells in TCM199 for 20~22 hr, and evaluated the nuclear type of oocyte. After in vitro maturation, oocytes were coincubated for in vitro fertilization with frozen-thawed spermatozoa selected by 65% percoll in DM-Heparin and DM-Caffeine for 15~18 hr. Presumptive zygotes were cultured for 48 hr in CR1aa in vitro culture medium with 10% FBS, and evaluated the cleavage rates. The results confirmed that the highest percentage of metaphase II (M-II) stage was observed in COCs (30.1±3.5%, 24.2±1.8%) as compared to DO (7.1±1.3%, 17.4±13.9%) (p<0.05). In addition, the increased cleavage rates were obtained from COCs (69.6±2.1%, 75.6±2.9%) when compared to DO (21.6±7.5%, 29.5±12.6%) (p<0.05). In conclusion, this study suggested that cumulus cells secreted positive factors during in vitro maturation of oocytes and early embryonic development after in vitro fertilization of bovine oocytes.

The objective of this study was to examine the effect of eCG and various concentrations (20, 40, and 80 ) of porcine FSH on nuclear maturation and intracellular glutathione (GSH) level of oocytes, and embryonic development after parthenogenetic activation (PA) and somatic cell nuclear transfer (SCNT) in pigs. Immature pig oocytes were matured in TCM-199 supplemented with porcine follicular fluid, cysteine, pyruvate, EGF, insulin, and hormones (10 IU/ml hCG and 10 IU/ml eCG or FSH) for the first 22 h and then further cultured in hormone-tree medium for an additional 22 h. Nuclear maturation of oocytes () was not influencem foreCG and various concentrations FSH. Embryonic development to the cleavage stage () and mean number of cells in blastocyst ( cells) after PA were not altered but blastocyst formation e-treignificaddlor(p<0.05) improvem forthe supplementation eith 80 FSHr(64%) compared to 47%, io8%, iand 47% in oocytes that were treated with eCG, 20,i and 40 FSH,i numectivelo. In SCNT, fusion () of cell-cytoplast couplets and siosequent embryo cleavage () were not influencem fordifferent gonadotropins but blastocyst formation tended to increase forthe supplementation eith 80 FSHr(25% vs. ). Our nuults demonstrated that oocyte maturation and embryonic development after PA and SCNT e-frinfluencem fortype of gcem fortype of gits concentration. In this study, supplementation of maturation medium eith 80 FSHrimproved preimplantation development of PA and SCNT pig embryos, probably by increasing intracellular GSH concentration of matured oocytes.

This study was conducted to examine the effects of human follicular fluid and gonadotropin (FSH+HCG+rhEGF) on in vitro maturation, fertilization and development of human immature oocytes. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were collected following for in vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET) cycles of the patients. At the time of oocytes collection, oocytes were classified into MII, MI and GV in accordance with their appearance (MII: Fully mature oocyte at metaphase II of meiosis; MI: Nearly mature oocytes at metaphase I of meiosis; GV: Immature oocytes at prophase I of meiosis). After controlled ovarian stimulation using gonadotropin(FSH) and human chorionic gonadotropin (HCG) in 70 ICSI cycles, 158 MI to MII matured oocytes were intracytoplasmic sperm injection (ICSI) h after in vitro culture and 553 MII oocytes were ICSI after denudation. The aspirated MI and GV oocytes were cultured in culture medium containing 10% (v/v) serum protein substitute (SPS), 10% (v/v) human follicular fluid (hFF) and 10% (v/v) serum protein substitute (SPS)+1 IU/ml FSH+10 IU/ml HCG+10 ng/ml recombinant human epidermal growth factor (rhEGF). The maturation rate of immature oocytes was similar among the three group. When maturation medium was supplemented with 10% SPS, 10% hFF or gonadotropins, the fertilization rate of in vitro matured oocytes was higher in 10% SPS (80.0%), but there was no statistical significance (78.2%; hFF, 76.9%; gonadotropin, p>0.05). The development rate of human embryos developed to cells were not significant difference in the medium containing SPS, hFF and gonadotropins (65.6%, 65.9% and 66.7%). The results of these study suggest that human follicular fluid and gonadotropins supplemented in the culture medium was not effected on the in vitro maturation, fertilization and development of human immature oocytes.

본 연구는 mSOF(modified synthetic oviduct fluid medium) 배양액을 이용하여 와 배양 소적에서 일본 흑우의 수정란 생산 효율을 개선하기 위하여 수행하였다. 난구세포가 부착된 미성숙 난자는 각각 단독 배양조건( 소적) 및 그룹 배양 조건 ( 소적)에서 실시하였고 배양액은 TCM-199의 기본 배지에 10% FCS, 0.02IU/ml FSH와 를 첨가하여 사용하였다. 배반포 단계로 발육한 수정란은 1.5M ethylene

본 연구는 안정된 돼지 체외 성숙 난자를 얻을 목적으로 배양액의 종류 및 배양액에 EGF, , 호르몬 첨가가 돼지 난포란의 체외 성숙에 미치는 영향을 조사하였다. 난포란을 TCM-199, NCSU-23 및 PZM-3으로 48시간 배양했을 때 체외 성숙율은 각각 및 였다. TCM-199로 48시간 배양했을 때 체외 성숙율은 NCSU-23 및 PZM-3 보다 약간 낮은 체외 발생율을 나타냈다. 난포란을 25 ng/ml의 EGF를 첨가한 TCM-199, NC

본 연구는 개의 미성숙난자의 낮은 성숙율을 개선하기 위하여 자연발정온 개의 생식기관에 미성숙 난자를 이식하여 체내 배양 난자를 회수하여 회수된 난자의 핵 성숙율을 조사한 결과는 다음과 같다. 1. 미성숙난자를 24, 48 및 72시간 동안 체외성숙을 유도하였을 때 성숙시간에 따른 체외성숙율에는 유의적 차이는 인정되지 않았다. 2. 체내 배양 기간에 따른 난자의 회수율은 배양기간이 길어질수록 유의적으로 낮은 회수율을 보였으며, 배양기간이 증가할수록 난자의

동결 과정 중 필수적인 단계중 하나인 냉각(cooling)과 냉각 후 배양시간이 생쥐 난자의 방추체의 형태와 염색체의 배열에 미치는 영향을 알아봄으로서 냉각 후 손상되었던 난자의 방추체와 염색체가 정상적으로 회복하는데 필요한 최적의 배양시간을 알아보기 위해 본 실험을 실시하였다. 생후 4-6주령의 암컷 B6C3Fl 생쥐를 과배란 처리하여 metaphase II상태의 난자를 회수하여 다음과 같이 처리하였다. 대조군은 난자를 냉각처리하지 않았으며 실험군은

본 연구는 동물복제 및 형질전환 동물생산 등의 연구에 기초자료를 제공하고자 재래산양의 oocyte를 단위발생을 유도하여 회수난자의 조건, 활성화방법, 배양조건 등이 단위발생란의 체외발달율에 미치는 영향을 조사하여 재래산 양의 최적의 배양조건을 확립하고자 실시하였다. 난자의 회수는 체중 15～25 Kg 전 ㆍ 후의 성숙한 미경산 재래산양에 FSH와 PMSG 를 사용하여 과배란을 유기하여 hCG 투여 후 제 35시간째에 외과적인 방법으로 in vivo (체내성숙) 난자는 난관을 관류하는 방법으로 회수하였고, in vitro (체외성숙) 난자는 난포로부터 흡입하여 난포란을 채취하여 약 22시간 체외성숙을 실시하였다. 활성화 처리는 전기자극법과 Ionomycin + 6-DMAP를 처리하여 단위발생을 유도하였다. 복제수정란의 배양은 M16, TCM-199 및 mSOF 배양액으로 6～7일 동안 체외배양을 실시하였다. 활성화를 유도하기 위하여 전기자극 및 ionomycin + 6-DMAP 처리를 하였을 때 분할율은 각각 64.1 및 76.5%로서 이들간에 차이는 없었다. 배반포기로의 발달율은 전기자극방법으로는 전혀 발달이 이루어지지 않았으나, ionomycin +6-DMAP 처리방법에서는 15.6%가 배반포로 발달하였다. In vivo 난자와 in vitro 난자를 활성화를 유도하였을 때 분할율은 86.8 및 69.0%로서 이들간에 유의적인 차이는 없었다. 4-세포기(93.9% vs 66.1%), 8-세포기(90.9% vs 37.0%) 및 상실배기(89.4% vs 23.6%)는 이들간에 유의적(P<0.05)인 차이가 있었으며, 배반포기로의 발달율은 체내성숙난자가 50.0%로서 체외성숙난자의 0.8%보다는 유의적으로 높았다. 활성화를 유도한 난자를 mSOF 배양액으로 체외배양을 실시하였을 때 분할율은 81.0%로서 TCM-199 +oviduct cell 의 64.3% 및 Ml6 배양액의 51.6%보다는 높게 나타났다. 배반포기로의 발달율은 mSOF 배양액에서는 3.4%가 발달하였으나, TCM-199+ oviduct cell 배양액과 M16 배양액에서는 전혀 발달이 이루어지지 않았다. 이상의 결과는 포유동물 난자의 단위발생의 유도 및 체외배양시 난자의 공급원, 난자의 활성화 방법 및 배양조건 등이 차후 단위발생란의 체외발생율에 크게 영향을 미칠 수 있는 근거를 제시해 준다.

본 연구는 개의 불임해결과 체외수정란을 생산할 목적으로 난소의 보존 및 난구세포의 부착 여부가 신선 및 동결 개 정자를 이용한 투명대 반응에 미치는 영향을 조사하였다. 1. 적출한 난소를 4 와 salt에 각각 48시간 보존 후 회수한 난구세포 부착 난자와 나화난자의 정자침입율은 각각 62.5%, 37.5% 및 42.5% 및 22.4%로서 난소를 적출 후 곧 바로 회수한 난구세포 부착 및 나화난자 내 정자침입율인 93.3%와 56.7%에 비해 현저히 낮

본 연구는 미성숙 돼지난자가 체외성숙배양액인 TCM-199과 NCSU-23배지에서의 배양상태를 비교하였고, 체외성숙용 TCM-199배지에 Earle'ssalt와 Hank's salt의 첨가에 의한 세포분화와 배발달 상태를 각각 조사하였다. 1. TCM-199와 NCSU-23 배양액에 각각의 supplement를 첨가하여 5% 조건하에서 체외성숙을 유기한 결과, TCM-199 배양액에서 유의성(p<0.05)이 검증되었다. 2. 체외성숙용 TCM-199배지