본 연구는 붉바리 어미의 사육환경에 따른 난질의 변화를 난의 생화학적 분석을 통하여 난질 에 영향을 미칠 수 있는 요소를 구명하기 위하여 수행하였다. 그 결과 육상수조에서 사육하는 것보다 해상가두리에서 사육할 때 부상률, 수정률, 난 발생 생존율 및 부화율이 우수하였다. 그 리고 해상가두리에서 생산한 수정란의 유리아미노산의 함량이 높았다. 즉, 해상가두리에서 사 육관리할 때 난질이 우수한 수정란을 생산할 수 있고, 난질이 우수할수록 유리아미노산의 함 량이 높았다.

The experimental fish transplanted from China in 2015 was used after seedling production and cultivated. Breeding management for experiment was carried out from October 2020 to February 2021. Also, it succeeded in inducing artificial maturation three to four months earlier than wild broodstock and secured good quality fertilized eggs. The average size of fertilized eggs was 1.22 mm, at 20℃ Blastodisc (15 minutes post-fertilization), 2 cell (50 minutes), 4 cell (1 hours), 8 cell (2 hours), 16 cell (2 hours and 30 minutes), 32 cell (2 hours and 50 minutes), morula (3 hours), blastula (8 hours), gastrula (15 hours), skull formation (20 hours), organ formation (30 hours) and hatching yolk larvae stage (35 hours). The total length of the just hatched larvae were 2.50 ± 2 mm, and then gain growth of 42.5 mm by 60 days, reaching 45 ± 5 mm.

체외 환경에서 생산되는 배아 (Embryo)는 활성산소종 (Reaction oxygen species, ROS) 수준이 일정 수준을 초과함에 따라 산화적인 손상을 받게 된다. 선행연구에 따르면, 항산화제는 ROS를 감소시켜주는 효과를 가지기 때문에 ROS로부터 오는 배아의 단백질, DNA의 손상, 세포 자멸사를 방지하여 배아의 발달률을 향상시킨다. 이전연구에 따르면 항산화제로써 엘라그산 (Ellagic acid, EA)은 ROS를 효과적으로 제거하고, 난자의 산화스트레스를 방지하는 효과를 가지고 있다고 보고되었다. 그리하여, 본 연구를 통해 우리는 소의 수정란 배양체계 중 in vitro culture (IVC) 단계에서 EA의 농도 (0, 5, 10 μM) 별 첨가가 소의 수정란 발달률과, 질적 수준에 미치는 영향을 조사하고자 실험을 진행하였다. 결과적으로, 배반포의 단계별 발달 수준에서 cleavage 형성률은 EA첨가군과 대조군 간의 차이를 발견할 수 없었으나 배반포 형성률에서는 모든 EA 첨가군들이 대조군보다 높았고 EA 첨가군 중에 5 μM 첨가군이 가장 높았다 (p < 0.05). 생산된 배반포의 총 세포 수는 5 μM EA 첨가군이 대조군과 10 μM EA 첨가군 보다 유의적으로 높았으며, 대조군과 10 μM EA 첨가군 사이의 유의적 차이는 없었다 (Control vs. 5 μM vs. 10 μM; 137 ± 7.90 vs. 163.2 ± 7.42 vs. 138.8 ± 6.67, p < 0.05). 세포 자멸사 세포 수는 모든 EA 첨가군들이 대조군보다 유의적으로 낮았다 (Control vs. 5 μM vs. 10 μM; 22.65 ± 4.08, 9.61 ± 1.55, 6.14 ± 0.90, p < 0.05). ROS 수준에서 모든 EA 첨가군들과 대조군 간의 유의적 차이는 없었다 (Control vs. 5 μM vs. 10 μM; 6.81 ± 1.31, 3.86 ± 0.23, 4.11 ± 0.18, p < 0.05). qRT-PCR 실험 결과에서 Nrf2 gene expression은 대조군과, 5 μM 첨가군에서 유의적 차이가 없었으나, 10 μM 첨가군에서는 유의적으로 상향 조절된 것을 관찰하였다. Keap1 gene expression은 5 μM 첨가군에서 유의적으로 하향 조절된 것을 관찰하였다. 하지만 EA의 농도가 10 μM으로 높아짐에 따라 발현 수준이 증가한 것을 관찰할 수 있었다. CAT gene expression은 5 μM 첨가군에서 유의적으로 상향조절 되었으나 10 μM 첨가군에서는 유의적인 차이를 보이지 않았다. SOD1 gene expression은 대조군과 5 μM 첨가군은 유의적인 차이를 보이지 않았으나 10 μM 첨가군에서는 유의적으로 상향 조절된 것을 관찰하였다.

This study was investigated to test whether the zygote recognized the topoisomerase II beta (TOP2B) mediated DNA fragmentation in epididymal spermatozoa or the nuclease degradation in vas deferens spermatozoa by testing for the presence of gammaH2AX (γH2AX). The γH2AX is phosphorylation of histone protein H2AX on serine 139 occurs at sites flanking DNA double-stranded breaks (DSBs). The presence of γH2AX in the pronuclei of mouse zygotes which were injected with DNA broke epididymal spermatozoa was tested by immunohistochemistry at 5 and 9 h post fertilization, respectively. Paternal pronuclei that arose from epididymal spermatozoa treated with divalent cations did not stain for γH2AX at 5 h. On the other hand, in embryos injected with vas deferences spermatozoa that had been treated with divalent cations, γH2AX was only present in paternal pronuclei, and not the maternal pronuclei at 5 h. Interestingly, both pronuclei stained positively for γH2AX for all treatments and controls at 9 h after sperm injection. In conclusion, the embryos recognize DNA that is damaged by nuclease, but not by TOP2B because H2AX in phosphorylated in paternal pronuclei resulting from spermatozoa treated with fragmented DNA from vas deferens spermatozoa treated with divalent cations, but not from epididymal spermatozoa treated the same way.

톱다리개미허리노린재는 콩과작물과 과수에 경제적 피해를 주는 주요해충이다. 본 연구는 톱다리개미허리노린재의 온도에 따른 산란특성을 규명하고 수정란을 이용한 산란모형과 생명표 매개변수를 추정하기 위하여 15.8, 19.7, 24.0, 27.8, 32.6, 34.0, 35.5℃ 정온조건에서 실험을 실시하였다. 15.8℃를 제외하고 조사된 모든 항온온도조건에서 산란이 가능하였다. 암컷 성충 수명은 15.8℃ (110.5일)에서 가장 길었으며 온도 가 올라갈수록 짧아지는 경향을 보였다(19.7℃에서 76.6일, 35.5℃에서 20.6일). 전체 산란수와 수정란수는 24.0℃ (193.5와 151.2)에서 가장 많았으며 부화율은 27.8℃ (84.0%)에서 가장 높았다. 전체 산란수와 수정란수를 이용하여 산란모형과 생명표 매개변수를 비교하였다. 수정란수 를 이용시 온도별 총산란수 모형의 추정된 총산란수(159개)는 전체 산란수(190개)를 이용했을 때보다 적었다. 생명표분석에서 수정란을 이용하였을 때 개체군순증가율과 평균세대기간은 전체 산란수를 이용한 결과보다 작은 값을 나타내었다. 수정란을 이용한 산란모형 작성과 생명표분석은 실질적인 개체군변이를 이해하는데 도움이 될 것이다.

These studies were conducted to evaluate developmental competence of follicular oocyte collected from the ovaries of Hanwoo cows with the high offspring meat quality (1++ and 1+ grade). Cumulus oocyte complexes from individual cows were matured, fertilized and cultured using protocols of in-vitro maturation (IVM), in-vitro fertilization (IVF) and in-vitro culture (IVC). The rates of blastocyst development from Hanwoo cows with the offspring meat quality grades of 1++ and 1+ were 18.6 and 21.2%, respectively. The rates of blastocyst development were 26.3, 20.7, 20.7, 17.2 and 31.2% from Hanwoo cows with the meat quality grades of 1++, 1+, 1, 2 and 3, respectively. Fiftyseven transferable embryos were recovered from 11 Hanwoo donor cows (5.2/head) with the high offspring meat quality grades of 1++ and 1+ in vivo, and the pregnancy rate after embryo transfer was 61.1%. In conclusion, these results suggest that in vitro embryo production from the ovaries of cows with the high meat quality grades using individual culture system can be used an efficient method for livestock improvement. In addition, for the successful industrialization of embryo transfer, conception rate should be improved.

미토콘드리아는 세포질 칼슘 항상성 및 ATP 생산에 중요한 역할을 하는 세포 소기관으로 이러한 미토콘드리아의 기능은 성숙과 수정 그리고 배 발달에 매우 중요한 역할을 한다. 미토콘드리아 칼슘 축적은 기능장애를 일으킨다. 그러나 돼지 체외성숙란 및 수정란에서 미토콘드리아 칼슘 변화의 관련성에 관한 연구는 보고된 적이 없다. 본 연구의 목적은 미토콘드리아 칼슘 지시자로 알려진 Rhod-2 염색을 이용하여 성숙란 및 수정란에서 미토콘드리아 칼슘 축적의 변화를 확인하였다. 형태학적 모습의 기준을 통해 난구세포의 세포층과 세포질의 균질도를 바탕으로 G1과 G2로 나누어서 체외성숙을 진행하였다. 이후 두 그룹에서 핵 성숙율을 비교하였을 때, G2가 G1에 비해 낮게 나타났다(p<0.001). 돼지 체외성숙란 및 수정란에서 평균적인 Rhod-2 spot 의 수는 G1보다 G2에서 더 많이 나타났다(6시간째 체외수정란: p<0.05). 다음으로 Rhod-2 spot 수에 따른 난모세포의 비율을 확인하기 위해 Rhod-2 spot 의 수를 4개의 군(n<10, 10≤n<20, 20≤n<30, 그리고 30≤n)으로 나누어 해당 난모세포의 비율을 확인하였다. 체외성숙란 및 체외수정란 모두 G1이 G2에 비해 10개 미만(n<10)인 Rhod-2 spot 의 수를 가지는 난모세포가 많았으며, 체외수정란에서는 유의적으로 높았다(p<0.05). 마지막으로 체외성숙란 및 수정란에서 Rhod-2 intensity 값을 측정하여 두 그룹을 비교하였을 때, G2가 G1에 비해 유의적으로 높은 것을 확인 할 수 있었다(성숙란; p<0.001 그리고 수정란; p<0.05). 본 연구의 결과를 토대로 돼지에서 미성숙 난포란의 형태학적인 품질은 체외성숙 및 체외수정 과정 동안 미토콘드리아 내 칼슘 축적과 관련이 있음을 확인하였다.

본 연구는 한우 번식우의 다양한 사료급여 방법에 의한 사양환경에서 체내 수정란의 회수율을 조사하고 혈중 주요 대사성분을 분석하고자 수행되었다. 연구자가 관리하고 있는 강원도 횡성에 위치한 4 농가(A~D)와 경기도 이천에 위치한 1 농가(E)를 대상으로 18 년 7 월~9 월간 실험이 이루어졌으며 5 농가에서의 사료 급여는 각 농후사료 2 kg + 건초 2 kg + 사일리지 1 kg(A 농가), 농후사료 3.5 kg + 볏짚 무제한(B 농가), 농후사료 3 kg + 건초 3 kg 2 회(C 농가), 농후사료 3.6 kg + 건초 4 kg(D 농가), TMR 5 kg(E 농가)의 방법에 따라 이루어졌다. 각 농가별 혈중 주요대사물질 분석을 위해 수정란 채란 당일 경정맥을 통해 혈액을 채취하였고 분리된 혈청은 -20℃에서 냉동보관 후 혈액분석기를 통해 NEFA, Glucose, BUN, Cholesterol, AST, GGT 항목을 일괄적으로 분석하였다. 공란우의 과배란 유도를 위하여 CIDR-plus(InterAg, Hamilton, New Zealand)를 질 내에 삽입 후 7 일째부터 FSH 제제인 Folltropin-V(Vetrepharm, Canada)를 투여하였고 총 FSH 200mg 을 40mg, 30mg, 20mg, 10mg 의 용량으로 오전, 오후 각 2 회씩 점감적으로 주사하여 총 8 회에 걸쳐 12 시간 간격으로 근육에 주사하였다. FSH 투여 3 일째에 PGF2a 제제인 Lutalyse(Zoetis, Belgium)를 25mg 1 회 투여하고 CIDR-plus 를 제거하였으며 FSH 투여 개시 후 5 일째, 오전에 GnRH 제제(Fertagyl; Intervet, USA)를 250ug 투여하고 12시간 간격으로 인공수정을 2 회 실시하였다. 수정란의 채란은 2 차 인공수정 7 일 후에 balloon catheter 를 자궁 내에 주입 및 장착하여 1-way 방법인 DEC(Direct Embryo Collection)에 의해 이루어졌다. 회수된 수정란은 회수된 총 수정란수, 이식가능한 수정란 수를 조사하였다. 실험결과, 회수된 총 수정란수는 A 농가 16±2 개, B 농가 36±3 개, C 농가 18±1 개, D 농가 12±1 개, E 농가 14±4 개로 확인되었으며 이식가능한 수정란수는 각 농가별 14±3 개, 22±3 개, 11±1 개, 6±3 개, 2±2 개로 조사되었다. 총 회수 수정란 대비 이식가능한 수정란의 이용효율은 A 농가가 87.7±3 %로 가장 높게 관찰되었으며 E 농가가 14.5±2 %로 가장 낮게 확인되었다. 공란우의 MPT 분석 결과, NEFA 는 A 농가 125.15 uEq/L, B 농가 185.40 uEq/L, C 농가 177.91 uEq/L, D 농가 103.53 uEq/L, E 농가 232.56 uEq/L 로 조사되었다. Glucose 는 각 농가별 48.00 mg/dl, 66.15 mg/dl, 68.73 mg/dl, 61.42 mg/dl, 39.74 mg/dl 로 분석되었으며 BUN 은 각 13.73 mg/dl, 15.07 mg/dl, 9.01 mg/dl, 16.64 mg/dl, 19.37 mg/dl 로 확인되었다. Cholesterol 은 각 179.85 mg/dl, 162.20 mg/dl, 142.36 mg/dl, 132.68 mg/dl, 152.95 mg/dl 로 분석되었으며 AST & GGT 는 85.00 & 17.60 IU/L, 78.75 & 17.50 IU/L, 75.95 & 22.91 IU/L, 79.26 & 13.42 IU/L, 89.58 & 21.89 IU/L 로 조사되었다. 결론적으로 체내 수정란의 이용효율과 MPT 분석결과를 비교하면 Glucose, BUN, Cholesterol, AST, GGT 의 경우 상관관계를 조사할 수 없었으나, NEFA 의 경우 체내 수정란의 이용효율이 14.3 %로 가장 낮게 관찰된 E 농가의 혈중 NEFA 농도가 232.58 uEq/L 로 가장 높게 관찰된 것이 차이점으로 조사되었다. 본 연구결과는 농촌진흥청 연구 사업(세부과제번호:PJ012695032018)의 지원에 의해 이루어진 것임.

현재까지 한우개량을 위해 가장 보편적으로 활용되고 있는 기술은 웅성 유전자원의 동결용 정액을 활용하는 인공수정기술로서 개량에 최소 6 세대 이상 즉, 암송아지만을 생산한다는 가정에서 15~20 년 이상의 시간이 소요될 뿐만 아니라 생산되는 산자 수 또한 한정적이다. 가축개량 효율을 높이기 위해 수정란이식 기술이 개발되었으며, 호르몬 투여에 의한 과배란 유래 체내 수정란 및 체외 수정란 생산 방법이 개발되어 활용되어 왔다. 체내 수정란 생산방법은 혈통관리는 정확하나 수정란 생산을 위해 호르몬 과다 투여에 의한 휴식기간 등이 필요하며 수정란의 생산량의 한계로 산업화 적용에 비효율적이고, 근래에 체외수정란을 활용되면서 도축 유래 수정란을 활용하는 경향이 있으나 친자 검정의 한계로 인한 친자 불일치 및 고도근친 위험성 등이 상존하고 있다. 이러한 문제를 극복하고 효율적인 이식 가능한 수정란의 생산이 가능한 OPU 유래 수정란 생산기술은 살아있는 공란우에서 난자를 채취하여 체외수정란을 생산함으로써 혈통관리가 정확하고 우수유전 자원을 선발 활용함으로써 계획 교배에 의한 근친도와 개량의 폭을 예측할 수 있는 장점이 있다. 또한 수정란의 생산 가능 량은 3~4 개월에 약 60 여 개의 이식 가능한 수정란을 대량 생산으로 산업화에 적합한 수정란 생산기술이다. 본 연구에서는 선발된 공란우의 반복 사용으로 우수 유전자원의 수정란을 대량생산에 활용하기 위해서 2013-2016 년까지 매년 3-4 개월 동안 주 2 회 채란 및 수정란을 생산하였고 채란 완료 후 일정 기간의 휴식한 다음 다시 채란에 활용으로 2 회 이상 수정란 생산으로 수정란의 반복 생산 가능성 및 생산 효율에 대하여 조사하였다. 2 반복의 공란우는 총 24 두와 3 반복은 7 두를 3-4 개월 동안/년 매주 2 회 총 1,626 회 채란으로 평균 3.6±2.9 개의 수정란이 생산되었다. 특히 채란 시 생산된 수정란은 채란 횟수당 1 회 반복에서 3.9±2.8 개, 2 회 반복은 3.3±2.7 개 및 3 회 반복은 3.5±3.3 개로 확인되었고, 3 회 이상의 반복 채란된 개체 7 두를 분석한 결과 1 회 반복 채란에서 평균 3.63±2.79 개, 2 회 반복은 평균 3.70±2.84 개 및 3 회 반복은 년 3.51±3.32 개로 반복 채란에 수정란 생산에 활용하였으며 반복 채란에 의한 수정란의 생산효율에는 유의적인 차이를 보이지 않았다. 따라서 가축개량을 위해 산업화에 가장 적합한 수정란 생산방법으로 유전능력이 우수한 한우에서 대량의 수정란을 생산하여 우량한우 집단구축을 위하여 약 3-4 개월 동안 매주 2 회 수정란을 생산하고 일정기간을 휴식한 다음 공란우로써 재활용 가능성을 확인하였고 또한 OPU 유래 수정란 생산방법은 우수한 유전자원을 보유한 개체를 연속적이며 반복적으로 활용할 수 있는 가능성을 확인하였다

본 연구는 한우 체외 수정란의 동결보존에 hyaluronate(HA), ethylene glycol(EG), glycerol(G), sucrose(S)를 사용한 동결배양액의 효과를 검증하고자 수행되었다. 체외 수정란 생산을 위해 도축장에서 회수된 난소로부터 미성숙 난자를 채취하여 체외성숙, 수정, 발달 배양을 실시하였다. 성숙배양은 0.5 ug/ml FSH, 5 ug/ml LH, 0.125% BSA(v/v)가 첨가된 mTCM199 배양액에서 38.5 ℃, 5 % CO2 의 조건으로 22 h 동안 실시하였으며 체외수정은 mTALP 배양액에서 38.5 ℃, 5 % CO2 의 조건에서 22 h 동안 이루어졌고 발달배양은 mSOFaa 배양액을 사용하여 38.5 ℃, 5 % CO2, 5 % O2 의 조건에서 이루어졌다. 동결에 이용된 수정란은 수정배양 후 7 일차의 배반포를 대상으로 하였다. 실험에 사용된 동결배양액은 대조군으로써 vigro 의 1.8M EG 에 0.1 M S 가 첨가된 제품을 사용하였고 처리군으로써 1.8M EG 배양액, 1.8M EG 에 0.1M S 와 1.7M G 이 첨가된 배양액, 1.8M EG 에 0.1M S, 1.7M G 및 0.0007 g/ml HA 가 첨가된 배양액을 사용하였다. 모든 처리군은 0.01 g/ml Albumax 가 첨가된 CJ buffer 를 동결배양액의 base 로 사용하였다. 동결방법은 0.25 ml 스트로에 장착된 수정란을 CL-8800i(CryoLogic)에 의한 –0.3℃/min 의 완만동결로 –32℃까지 냉각시킨 후 액체질소에 침지하여 실시하였다. 동결과정 중, -6℃에서 스트로의 말단 부분에 식빙을 실시하였다. 동결융해 후 생존율 조사를 위해 동결보존 중인 스트로 32℃의 온수에서 25 초간 융해를 실시하여 발달배양액에서 48 시간 배양하여 총 동결융해 수정란에 대한 재확장율 및 부화율을 통해 생존율을 확인하였다. 실험결과, 동결융해 후 재확장율은 대조군(EG+S)과 EG, EG+S+G, EG+S+G+HA 에서 각 90.1±0.5, 76.0±1.0, ±85.4±2.1, 84.9±0.5 %로 관찰되었으며 부화율은 80.2±1.0, 70.8±4.2, 74.0±1.0, 82.8±1.6 %로 확인되었다. 재확장율은 대조군인 1.8M EG + 0.1M sucrose 배양액에서 90.1±0.5 %로 가장 유의적으로 높게 관찰되었으며 부화율은 대조군과 1.8M EG + 0.1M sucrose + 1.7M glycerol + 0.0007 g/ml HA 처리군에서 각 80.2±1.0 %와 82.8±1.6 %로 가장 유의적으로 높게 관찰되었다(p<0.05). 추가적으로 본 동결방법에 의해 생산된 동결수정란의 수정란이식을 실시하여 수태율을 조사하고 있지만 결과가 부족하여 본 연구결과에서 포함시키지 못하였다. 하지만 수정란 이식과정에서 EG+S+G 처리군의 경우 30 분이 경과된 시점부터 다른 처리군보다 수태율이 감소되는 경향이 뚜렷하게 관찰되었다. 반면, glycerol 과 HA 가 함께 첨가된 다른 동결배양액의 경우에는 이러한 경향이 관찰되지 않았다. 다른 체외수정란의 발달연구에서 HA 의 첨가는 부화율을 증가시킨다는 연구결과가 보고된 바 있는데 이러한 연구결과와 일치된다고 생각된다. 본 연구결과는 농촌진흥청 연구사업(세부과제번호:PJ012695032018)의 지원에 의해 이루어진 것임.

OPU 유래 수정란 생산 및 이식은 기존의 체내 및 체외 수정란 생산과 이식의 단점을 해결하고 한우 개량을 촉진 시킬 수 있는 기술이다. 특히 살아있는 공란우를 활용하므로 모계와 부계에 대한 혈통관리가 정확하고 또한 선발된 공란우와 계획 교배를 통하여 가장 적합한 동결정액을 사용하여 개량의 효과를 극대화가 가능하고 또한 현재까지 생산효율이 가장 높은 생산기술이다. 따라서 기존의 수정란 생산방법보다 공란우의 선발강도를 더 높일 수 있어 개량의 효과를 극대화 할 수 있는 장점이 있다. 본 연구실에서는 2009 년도부터 OPU 유래 수정란을 생산하여 이식하여 수정란이식이 산업화로 전개될 수 있도록 진행하고 있다. 특히 한우에 대한 우수성 확보, 개량 및 그 다음 세대 후대의 근친적인 문제가 발생되지 않도록 수정란이식에 의해 탄생된 송아지 혈통관리를 위한 친자검정으로 수정란에 대한 신뢰성을 높여 수정란 이식이 산업화가 될 수 있도록 진행하였다. 본 연구에 대한 조사는 2013 년도 7 개의 시·군을 시작으로 ‘14 년도 11 개, ‘15 년도 15 개, ‘16년도 17 개의 시·군으로 점진적으로 확대됨에 따라 공란우의 두수도 ‘13 년도 35 두를 시작으로 ‘16 년도는 71 두로 증가되었다. 조사된 4 년동안 각 지역에서 선발된 유전능력이 우수한 공란우는 총 211 두에서 수정란을 총 18,839 개, 두당 89.3 개를 생산하였다. 두당 생산 효율도 ‘13 도에는 회당 3.0±4.5 개에서 ‘16 년도에는 4.8±2.2 로 회당 이식 가능한 수정란의 생산량이 년도에 따라 꾸준히 향상되었다. 생산된 수정란은 자연발정 또는 발정동기화를 통하여 매주 2 회 이상 이식으로 ‘13 년 49.7%, ‘14 년 51.9%, ‘15 년 52.9%와 ‘16 년 47.9%의 수태율을 확인하였다. 이는 년도가 증가되면서 수정란의 생산성의 향상과 적정 수준의 수태율의 성과는 시술자와 농가의 적극적인 참여에 의한 결과로 판단되고 또한 유전능력이 우수한 수정란의 대량생산 및 공급으로 개량의 효과가 증가되고 우수한 한우 집단 구축으로 한우산업이 지속적으로 발전 할 것으로 판단된다.

This study aimed to produce high-quality blastocysts and establish appropriate microinjection conditions for the introduction of target gene. First, we identified embryo development to the blastocyst stage after microinjection using the CRISPR/Cas9 system on the Cas9 protein or mRNA. As a result, we confirmed that blastocyst development in the Cas9 mRNA injected group significantly increased when compared to the Cas9 protein injected group (p<0.05). However, the blastocyst gene targeting rate increased in the Cas9 protein injected group when compared to the Cas9 mRNA injected group (p<0.05). Next, we treated the injection medium with 10 μg/ml of cytochalasin B (CB), and the microinjected embryos were cultured in CR1-aa medium supplemented with 0.1 μM of melatonin (Mela). Consequently, the blastocyst formation rate significantly increased in the CB treated group (p<0.05). After microinjecting embryos with the CB treated injection medium, we investigated blastocyst formation and quality via Mela treatment. Consequently, the Mela treated group demonstrated significantly increased blastocyst formation rates when compared to the non-treated group (p<0.05). Furthermore, immunofluorescence assay using RAD51 (DNA repair detection protein) and H2AX139ph (DNA damage detection protein) showed an increase in RAD51 positive cells in Mela treated embryos. Therefore, we verified the improvement in knock-in efficiency in microinjected bovine embryos using Cas9 protein. These results also demonstrated that the positive effect of the CB and Mela treatments improved the embryonic developmental competence and blastocyst qualities in genetically-edited bovine embryos.

To increase the productivity of in vitro development, the antioxidants have been used for culture system of bovine oocytes and embryos. However, comparative studies on these molecules are rare and direct beneficial effects on blastocyst production cannot be discriminated for best results. The study was conducted to determine the influence of N-acetyl-L-cysteine (NAC), N-acetyl-L-cysteine amide (NACA), glutathione (GSH) and cysteamime (CYS) on maturation competence of COCs from GV to MII stage and productivity of blastocyst formation during in vitro fertilization and culture. There was no difference among maturation rates of oocytes to metaphase II with polar body with antioxidants for any of the treatment groups (p>0.05). However, the significant improvement on the rate of blastocysts (32.3±5.0%) was found in 0.1 mM CYS treatment than 0.3 mM NAC, 0.2 mM NACA or 0.5mM GSH (p<0.05). The addition of NAC (18.8±3.7%) or NACA (21.2±3.9%) did not improve development competence to morula and blastocysts than control (24.4±4.1%) and GSH (26.5±5.0%) (p>0.05). Our study showed that medium supplementation with CYS during IVM and IVC improved the rate of bovine embryo development but not with NAC, NACA and GSH addition.

Commercial applications of OPU/IVP were to produce embryos and calves from high genetic cows.The aim of this present study was to compare the number of recovered oocytes and cultured in vitro produced embryos from Ovum Pick-up (OPU). OPU derived embryo production was carried out of oocytes by ultrasonographic guided follicular aspiration and then produced in vitro produced blastocysts by IVP culture system. In result, the rate of recovered oocytes was obtained 612 (57.2%) and 451(73.7) G1+G2 grade oocytes. No difference of recovered rate (51.1~62.1%) was seen in six donor. The rate of cleavage and blastocyst development were obtained 320 (70.9%) and 78 (24.4%) that was 3.3±0.4 cleaved embryo and 0.9±0.2 blastocysts per session. Cleavage rate of OPU oocytes in No. 6 donor was 90.6%, significantly (P<0.05) higher than that in the other donors, However, blastocysts was similar (25.8~30.0%). In conclusion, limited numbers of OPU oocytes had competent development when cultured in SOF culture medium

소의 수정란 생산과 이식에 대한 연구는 한우의 개량과 증식 그리고 한우 유전자원의 안정적인 관리로 산업적 활용성을 증대 시킬 수 있다. 따라서 본 연구에서는 한우의 생체 에서 난포란을 채란에 따른 효율성을 높이기 위해서 연구를 수행하였다. 생체난포란 채란 을 위한 한우 공란우는 한우연구소에서 사육중인 한우에서 실시하였다. 생체 내 난포란의 관찰은 MyLabTM30VETGOLD(Esaote, Genova, ITALY) 및 탐촉자(EC123; Micro-Convex 9∼3 MHz, Esaote, Genova, ITALY)는 6.6 MHz convex scanner를 사용하였고, 난포란 채란에 사용된 주사침은 19G 주사침을 사용하였다. Monitor Image에 고정된 2 mm 이상 의 난포에서 난포의 수량을 확인하고 난포란을 흡인하였다. 흡입된 난포란은 2∼3회 washing으로 혈액 등의 이물질을 제거하여 실체현미경 하에서 회수하였고, 난포란의 등 급분류는 세포질 균일도와 난구세포의 부착 정도에 따라 평가기준을 1등급에서 3등급까 지 분류하였다. 회수된 난포란의 체외성숙배양은 TCM 199 기본배양액에 소 태아혈청(Fetal Bovine Serum) 0.5%와 LH, FSH, FGF, EGF 첨가하여 22시간 동안 배양하였고, 체외수정은 IVF 100(IFP, Japan) 배양액 50μl 미소적에 성숙 난포란 20개씩 넣어서 체외수정을 실시 하였다. 체외수정을 위해서 KPN 동결정액을 사용하였고 수정을 위한 정자의 최종 농도 는 2x106/ml로 6시간 동안 체외수정을 유도하였다. 체외배양은 조건은 5% O2, 5% CO2, 그리고 90% N2 와 38.5°C 인큐베이터에서 배양하였다. 수정율은 체외수정 후 48시간째 확인하였고 배반포 수정란 발달율은 체외수정 후 192시간째 확인하였다. 농후사료 급여량 에 따른 난포란의 회수효율은 2.0kg/일 급여시 초음파상에서 채취가능 난포란은 9.6개, 3.0kg일 때는 8.8개로서 유의적인 차이는 없었으나, 2.0kg 급여시에 다소 높은 난포란을 확인하였다. 생체 채취된 난포란의 체외배양에 따른 수정란의 발달율은 IVD 배양액에서 15.6%, CR1aa 26.2%, SOF 37.1% 발달율로서 IVD 배양액보다 SOF 배양액에서 유의적 으로(P<0.05) 높은 발달율을 보였다. 배양액 종류에 따른 동결 융해후의 생존율은 66.7%, 64.7%, 70% 각각 나타내었다. 생체난포란을 활용한 수정란이식을 위해서 체외배양시스템 의 안정적인 시스템 구축이 필요하며 생체채취 난포란의 회수를 위한 시술자의 기술적인 숙련도가 상승되었을 때 효율성을 제고할 수 있을 것으로 시료된다.

난자생검(Ovum pick up, 이하 OPU) 기법은 유효축군 조기확보 및 우수한우 유전자 원의 조기증식, 희소유전자원 다량확보를 위해 매우 중요한 기법으로 주목받고 있다. 이 러한 OPU기술에는 체외배양기술 외에도 현장의 환경과 시기에 따라 회수되는 난자의 수 역시 중요하다. 현재, 가축센터에서는 한우의 유전자 다양성 확보를 위한 일반 한우 외에 도 희소한우 증식을 위한 연구를 진행 중에 있다. 본 연구는 OPU기법을 활용하여 가축 유전자원센터에서 보유중인 한우 또는 칡소를 대상으로 계절별 및 모색별로 난포란의 개 수와 난자회수율의 차이를 비교 · 검토하고자 실험을 진행하였다. 실험시기는 3월에서 5 월(봄), 6월에서 8월(여름), 9월부터 11월(가을)까지 구분하여 실시하였으며, 계절별 및 모 색별로 채취되는 난자의 개수와 회수율을 분석을 하였다. 봄에는 8.20±6.57, 여름에는 5.47±4.01, 가을에는 5.88±3.65개가 회수되었으며, 또한 계통별로는 가을에 실시한 결과 한 우는 6.40±6.15개, 칡소는 2.75±0.55개가 회수되었다. 그리고, 계통별로 수정란발달률은 한 우는 난할률이 25.0±44.4%, 배반포발달률이 6.3±50.0%, 칡소의 경우 난할률이 27.3±21.0%, 배반포발달률이 9.1±16.7%로 나타났다. 계절별로 OPU를 실시한 결과 여름, 가을경에 실 시하는 것에 비해서 봄에 실시를 하였을 경우 회수되는 난자의 수가 많은 것으로 확인을 하였다. 그리고, 현재 일반한우가 칡소에 비해서 회수되는 난자가 더 많은 것으로 확인되 었다. 이에 반하여 난할률 및 배반포발달률은 차이가 없는 것으로 확인되었으나, 향후 실 험진행에 따라 정확한 결과를 도출할 것으로 사료된다.

The study aims to assess the embryo development and survivability of bovine embryos cultured in vitro by addition of cysteine. The rates of metaphase II formation are not significantly different among the three groups(73.8% for TCM199, 76.9% for TCM199 with 0.3mM cysteine and 83.8% for TCM199 with 0.5mM cysteine). No differences on cleavage rate(70.6~74.6%) was observed among three culture medium(70.6% for TCM199, 71.3% for CR1aa, and 74.6% for SOF) with 0.5mM cysteine. However, significantly(P<0.05) higher development rate was obtained in the blastocyst stage by adding 0.5mM cysteine in SOF medium(35.6%) than in TCM199(27.6%) or CR1aa(26.6%). No significant differences in the cleavage rates were observed among the three culture. After freezing the blastocysts cultured with 0.5M cysteine, the re-expansion rates ranged from 61.3% to 86.4% among groups, and hatching rates are from 26.3% to 46.9% among groups. The rates of re-expansion and hatching are significantly(P<0.05) higher in SOF medium(86.4% and 46.9%, respectively) than those in TCM199(61.3% and 26.3%) and CR1aa medium(87.1 and 44.4%). After thawing, the blastocyst re-expansion rate become significantly(P<0.05) higher in in vivo (87.1%) and in vitro (70.3%) embryos. In conclusion, our results demonstrate that supplementation of IVM and IVC media with 0.5mM cysteine improved the quality of in vitro production of embryo and post-thawed embryo. Future studies comparing these culture systems in well-designed trials should be performed.

Value of excellent breeding animals is important in livestock industry, but their economic life time is limited. And, many countries have been trying procuration of genetic resource in good animals. Therefore, this study was conducted to determine embryo production and to test efficiency of embryo transfer via non-surgical artificial insemination (AI) in different breed of superior sows. A total of 17 sows were used in this experiment (Duroc, n=10; Landrace, n=4; Yorkshire, n=3). The sows were artificially inseminated by semen of same breed boars. After 4 or 5 days following the AI, the embryos were obtained from the sows and then transferred to Landrace and Yorkshire recipients (n=3, respectively) by non-surgical method. The corpora lutea tended to be increased in Yorkshire and Landrace than Duroc(28 and 26 vs. 17, respectively). The recovery of embryo was 78.8% in Landrace, 65.4% in Duroc and 51.4% in Yorkshire. Duroc showed lower morulaes and early blastocyst embryos than 2, 4 ,8 and 16 cell. The morula in Yorkshire was higher (P<0.05) than that of Duroc (4.7 vs. 3.4). Similarly, the morulaes and early blastocyst embryos presented greater (P<0.05) in Landrace compared with other breed sows. The recipient sows were pregnant in a Landrace only. This reason may be due to little embryos inserted in the recipients. In addition, pregnancy results were limited because of the little sows. In conclusion, ovulated ovum in sows can be affected by different breed. Also, further study needed pregnant test by using the many embryo in each breed.

The objective of this study was to investigate the result of in vivo embryo collection and pregnancy rate after embryo transfer using sex-sorted sperm of Korean brindle cattle. Donor Korean brindle cattle superovulation treated by decreasing dose of FSH injection. Embryos were recovered on 7 days after the third artificial insemination. Control group semen straw used artificial insemination contained 20 million sperm. Sex-sorted semen straws contained 4 million sperm or 10 million sperm. As for the result of the recovery of the in vivo embryos derived from sex-sorted sperm, the number of transferable embryos was significantly highly recovered to be 6.20±2.28/donor from the control group and was significantly lowly recovered to be 1.57±1.72/donor from the group treated at a sperm concentration of 10×106 (p<0.05). The number of unfertilized embryo was 0.8±1.30/donor in control group which was significantly lower than the group treated at a sperm concentration of 4×106 (p<0.05). However, there was no significant difference in the number of undeveloped ova between control and treatment groups. Pregnancy rate after embryo transfer was shown to be 35.00% in control group and 12.50% in treatment group. The karyotype analysis of the calf derived from sex-sorted sperm resulted in a similar chromosomal distribution pattern (2n=60, XX) compared to those of common Korean native cattle.

Many pronuclear stage eggs were used to generate transgenic mice (Tg) by microinjection. In this study, we used in vitro fertilized mouse eggs, followed by ultrarapid freezing to establish a simple procedure for production of Tg mice. We produced in vitro fertilized mouse eggs and cryopreserved them by ultrarapid freezing method. A total of 139 cryopreserved-thawed pronuclear eggs, of which 101 (72.6%) were survived following microinjection of chicken b-actin promoter-driven firefly improved luciferase cDNA (β-act/luc+) and were transferred into 5 recipients. All recipients became pregnant and gave birth to a total of 15 (14.8%) pups. As a control, same DNA construction (β- act/luc+) was also injected into 450 in vitro fertilized eggs, of which 338 (75.1%) were survived and then were transferred into 14 recipients. Eleven (78%) mice became pregnant and littered a total of 54 (19.1%) pups. Southern blotting analysis of Tg mice indicated that one (1/15, 6.6%) and three (3/54, 5.5%) transgenic mice were production from cryopreserved and in vitro fertilized eggs, respectively. All Tg mice produced from both eggs showed the expression of improved luciferase gene. These results indicated that efficiency of produced of Tg mice from cryopreserved eggs was comparable to that from in vitro fertilized eggs. Furthermore, it is suggested that microinjection of transgene into in vitro fertilized eggs cryopreserved by ultrarapid freezing is an easy and conveniently method for production of Tg mice.