Recently, active research in Korea and worldwide has begun to focus on gene function and cultivar development using gene editing tools. This research, in addition to studies on edible mushroom, aims to enhance the physical and biochemical characteristics of mushrooms for applications in materials and substance production. For these studies, efficient isolation of protoplasts from the target mushroom is critical. However, several commercial cell wall-lysing enzyme cocktails, including Novozyme234, Glucanex, and Lysing enzymes, have recently been discontinued. In this study, we aimed to identify alternative enzyme systems to replace the discontinued cell wall-lysing enzymes for stable isolation of protoplasts from Ganoderma lucidum. To select an optimal osmotic buffer, enzyme function in 0.6 and 1.2 M Sorbitol, Sucrose, Mannitol, and KCl was assessed. The effect of reaction time was also evaluated. Protoplast isolation efficiency of each alternative enzyme was tested using lysing enzymes from Trichoderma harzianum, Chimax-N, and Yatalase, either individually or in combination. This matrix of studies identified enzymes and optimal conditions that could replace the discontinued lysing enzymes.

Despite the long history of mushroom use, studies examining the genetic function of mushrooms and the development of new varieties via bio-molecular methods are significantly lacking compared to those examining other organisms. However, owing to recent developments, attempts have been made to use a novel gene-editing technique involving CRISPR/Cas9 technology and genetic scissors in mushroom studies. In particular, research is actively being conducted to utilize ribonucleoprotein particles (RNPs) that can be genetically edited with high efficiency without foreign gene insertion for ease of selection. However, RNPs are too large for Cas9 protein to pass through the cell membrane of the protoplasmic reticulum. Furthermore, guide RNA is unstable and can be easily decomposed, which remarkably affects gene editing efficiency. In this study, nanoparticles were used to mitigate the shortcomings of RNP-based gene editing techniques and to obtain transformants stably. We used Lentinula edodes (shiitake mushroom) Sanjo705-13 monokaryon strain, which has been successfully used in previous genome editing experiments. To identify a suitable osmotic buffer for the isolation of protoplast, 0.6 M and 1.2 M sucrose, mannitol, sorbitol, and KCl were treated, respectively. In addition, with various nanoparticle-forming materials, experiments were conducted to confirm genome editing efficiency via the formation of nanoparticles with calcium phosphate (CaP), which can be bound to Cas9 protein without any additional amino acid modification. RNPs/NP complex was successfully formed and protected nuclease activity with nucleotide sequence specificity.

현재 양송이 품종의 개발은 1980년대에 개발된 방법에 의존하여 진행되고 있다. 유전자가위를 이용한 유전자교정 기술이 다양한 분야에서 각광받고 있고, 이 기술을 버섯 육종에도 적용하기 위하여 진행된 이 연구에서는, CRISPR/Cas9 활용에 필수적인 원형질체 분리 효율을 1.0 × 10 8 /mL까지 안정적으로 끌어올렸고, spermidine을 이용하여PEG 형질전환의 효율 또한 기존 방법에 비해 100배가량 끌어올렸음을 보고한다.

원형질체 융합 기술은 종·속간 유전적 한계를 넘어 육종과 그 소재로 활용하고데 목적이 있다. 본 연구에서는 ‘흑타리’(P. ostreatus)와 ‘호산’(P. pulmonarius)의 단핵균사를 이용하여 원형질체를 나출하고 나출된 원형질체를 융합하여 종간 교배 계통을 육성하였다. 육성계통의 균사생장속도는 ‘호산’, ‘흑타리’, PF160313, PF160306 계통 순으로 빠른 편이었다. 균사 밀도는 PF160306 계통이 가장 높았고, 나머지는 중간 수준의 밀도를 나타내었다. 원형질체 융합계통인 PF160306과 PF160313 계통은 ‘흑타리’ 품종 보다 배양 기간이 10일, ‘호산’ 품종보다 2일 단축되었다. 자실체 생장 기간은 ‘흑타리’와 ‘호산에 비하여 각각 3일, 1일 단축되었다. PF160306 계통의 생산량은 135.9 g/병으로 ‘호산’에 비하여 높았으나 통계적으로 유의차가 없었다. 자실체 발생기간은 15˚C에서 9일, 25˚C에서 4.5일로 온도가 높아짐에 빨라졌다. 자실체의 갓색은 21 o C 노란색이 가장 선명하게 발현되었다. URP primer 7을 사용하여 PCR 밴드 패턴을 비교하였을 때, 전체적으로 ‘호산’ 품종과 유사하였다. DPPH radical 소거능과 폴리페놀 함량에 있어 ‘순정’은 각각 62.5%, 43.5 mg/mL였으며, PF160313 계통은 각각 65.7%, 49.9 mg/mL를 나타내어 계통간 유의차가 있었다. ACE 활성은 ‘순정’ 74%, PF160313 계통 75%로 유사한 수준이었다.

The production scale of mushroom cultivation in Korea is approximately 600 billion won, which is 1.6% of the Korean gross agricultural output. Annually, ca. 190,000 tons of mushrooms are harvested in Korea. The oyster mushroom is one of the most favorite and commonly consumed mushrooms in Korea. In case of breeding, the protoplast fusion technique of the oyster mushroom, P. ostreatus was first commercialized in the world. To develop the high temperature varieties, various examinations were accomplished. Protoplast fusion of abalone mushroom, high temperature, and oyster mushroom, popular mushroom, were attempted. 2 strains of P.ostreatus and 2 strains of P.abalonus were fused to each other by protoplast isolation. Fusion strains were investigated by random amplified polymorphic DNA(RAPD) marker, and selected strains were cultivated at 25°C after completing the mycelial growth. As a result of sawdust bag cultivation, most of strains showed the fruiting body, but the morphological characteristics among them were not significant different. However, these protoplast fusion strains were expected as new parents strains to develop varieties.

Hypsizigus marmoreus is commercially the most important edible mushroom in Japan. This mushroom is usually cultivatedfor a longer period (about 85~120 days) than other mushroom. In order to develop a new cultivar that has a shortened cultivationperiod, the genome analysis of this strain has been considered. This study aims to obtain parental monokaryotic strains reproducing‘Haemi’ cultivar in Hypsizigus marmoreus for reference genome sequencing. The mycelia were cultured in MCM and MYG media forvarious incubation periods. Homogenized mycelia were treated with commercial cell wall degrading enzymes to maximize protoplastsproduction yield from Hypsizigus marmoreus. The greatest number of protoplasts was obtained from mycelia cultured in MCM mediafor 3 days using Novozyme enzyme. The isolated protoplasts were grown in regeneration agar media after two weeks. Regeneratedcolonies were picked and moved on separated dishes for microscopic observation. Neohaplonts regenerated from dikayotic strainswere identified by the absence of clamp connections. We confirmed that one of monokaryotic strains is a parental strain by crossingwith an original compatible strain of ‘Haemi’ cultivar. This parental strain will be used for reference genome sequence analysis.

Four Ganoderma lucidum strains, Chizhi 05, Jingda, Huizhou and Xinzhou, were screened out as hybrid parent in order to establish G. lucidum cross breeding system that based on protoplast monokaryogenesis method. Monokaryotic strains of each parental strains were obtained and mating type of each monokaryotic strains were determined. One to three monokaryotic strains that have different mating types were mated, and hybrids were identified by clamp connection observation and antagonist response. The results showed that the number of monokaryon came from Chizhi 05, Jingda, Huizhou and Xinzhou was 9, 14, 40 and 38, respectively. Only one mating type was obtained from Jingda, and two mating types were obtained from the other three strains, Chizhi 05, Huizhou and Xinzhou, respectively. Chi-square test showed that the ratio of two mating types of the three strains was 1:1. Fourteen monokaryotic strains of different mating types from 4 parental strains were select as a cross- breeding materia, and 17 hybrids were obtained, which were identified by clamp connection observation and antagonist response. This study proclaimed that the practicality of the hybridization breeding of G. lucidum by protoplast monokaryogenesis method.

원형질체 융합에 의한 화합성 및 불화합성 종간 체세포잡종을 얻었다. 화합성 종간인 Pleurotus ostreatus 와 P. florida 의 융합체는 이질핵체 (heterokaryon) 를 형성하였고, 불화합성 종간인 P. cornucopiae + P. florida , P. ostreatus + Ganoderma applanatum, P. florida + Ganoderma lucidum, 그리고 P. ostreatus + Flammulina velutipes 는 합핵체(synkaryon) 를 형성하였다. 이질이핵체는 동일한 양상의 자실체를 형성하는데 비해 합핵체는 유사분열상의 꺽쇠연결체 형성, 한쪽 친과 유사한 자실체 형성, 비정상적 유전형질 분리 및 유전자재조합 현상을 나타내었다. 화합성 및 불화합성 계통간 융합체의 RAPD 분석결과 화합성 종간 융합체는 동일한 DNA 패턴을 나타내었고, 불화합성 종간 융합체는 한쪽 친과 유사한 DNA 양상이면서 비양친 DNA 밴드도 형성하였다. 합핵체의 패턴은 microgenome insertion type 과 macrogenome insertion type 으로 구분되었다. 합핵체의 자실체 발생은 융합 모균주 양친의 자가임성에 의존하는데 이는 느타리의 동형핵체 자가임성과 유사한 양상이었고, 교배형 전환과 관련이 있는 것으로 사료된다. 여기서는 이러한 관점에서 논할 것이다.

약용버섯인 영지버섯의 단핵균주 육성 및 원형질체 융합을 위한 육종소재를 개발하기 위하여 원형질체를 분리하여 neohaplont를 육성하였으며, 원형질체에 자외선을 조사하여 영양요구성 균주를 유발하였다. 영지의 2핵 균주로 부터 원형질체를 분리, 재생하여 선발된 neohaplont의 선발율은 ASI 7091이 11.9%, ASI 7094는 전혀 선발을 하지 못하였으며 균주간 평균 선발율은 5.24%였다. 영지 단핵균주의 균사체로부터 분리한 원형질체에 자외선을 조사하였을 때 300초에서는 ASI 7074는 1.9%, ASI 7091은 0.17%의 생존율을 나타내었고 ASI 7100의 경우 모두 사멸하였다. 자외선을 10초에서 300초까지 자외선을 조사하여 총 1,536 colony를 얻어 영양요구주를 선발한 결과 ASI 7091 균주는 원형질체에 100초 처리한 colony에서 Nicotinic acid, PABA 요구주와 Riboflavin 요구주를 선발하였으며, 7100 균주에서는 60초의 자외선 처리에서 특성이 확인되지 않은 2개 균주를 선발하였다.

This study was to provide the basic data in improving protoplast formation and regeneration of antagonistic bacteria against phytopathogenic fungi and pest. The antagonistic rhizobacterium, BS 101, against Rhizoctonia solrmi and Fusurium oxyspomm was isol

Petunia hybrida와 Nicotiana sanderae의 원형질체(原形質體) 융합(融合)에 의한 체세포잡종식물(體細胞雜種植物)을 얻기 위하여 원형질체융합(原形質體融合)에 미치는 융합제(融合濟)의 종류, PEG의 처리시간(處理時間) 및 융합시(融合時) 온도(溫度), 융합용액(融合溶液)과 희석용액내(稀釋溶液內)의 의 양(量) 및 희석용액(稀釋溶液)의 pH에 대해 실험(實驗)하였으며 그 결과(結果)는 다음과 같다. 두 종(種)의 원형질체(原形質體)를 5.5mM이 함유(含有)된 PEG 6,000 30%용액(溶液)으로 에서 10분간 처리(處理)한 후 50mM이 함유(含有)된 희석용액(稀釋溶液)의 pH를 9.0으로 조절(調節)한 용액(溶液)으로 희석(稀釋)시켰을 때 원형질체(原形質體) 융합율(融合率)이 가장 높았다.

완두엽육세포(葉肉細胞)의 원형질체분리(原形質體分離) 및 융합(融合)에 있어서 효소(酵素)의 처리시간(處理時間), 의 효과(效果), 효소(酵素)의 농도(濃度)와 엽(葉)의 위치(位置)에 따른 원형질체(原形質體)의 분리(分離)에 미치는 영향(影響)과 Mole 농도(濃度)에 따른 원심분리효과(遠心分離效果), PEG용액(溶液)의 처리시간(處理時間), 산도(酸度)에 따른 융합효과(融合效果) 그리고 dimethyl sulfoxide 첨가효과(添加效果)를 구명(究明)하기 위하여 실시(實施)한 실험(實驗)의 결과(結果)는 다음과 같다. 1. 원형질체(原形質體)의 분리(分離)에는 4시간(時間)의 산소처리(酸素處理)가 가장 양호(良好)했고 의 첨가(添加)에 따라 원형질체(原形質體)의 분리속도(分離速度)가 늦어졌으며 활성도(活性度)는 4시간(時間)까지 변동(變動)이 없었고 의해서 활성도(活性度)가 장기간(長期間) 유지(維持)되었다. 2. 산소(酸素)의 농도(濃度)는 1% 이상의 처리(處理)에서 거의 동일(同一)한 원형질체분리율(原形質體分離率)을 나타냈으며 상위(上位) 1~2엽(葉)이 가장 좋은 원형질체분리율(原形質體分離率)을 보였으며 원심분리효과(遠心分離效果)는 0.4M, 0.5M에서 양호(良好)하였다. 3. 원형질체융합(原形質體融合)은 PEG 6000용액(溶液) 75분(分) 처리(處理)에서 좋은 융합율(融合率)을 보였다. 그러나 30분(分) 이내(以內)의 처리(處理)가 활성도(活性度)에 영향(影響)을 미치지 않았으며 pH 5.8인 PEG 6000의 0.2M용액(溶液)에서 가장 높은 62.84%의 융합율(融合率)을 나타내었다. dimethyl sulfoxide에 의한 효과(效果)는 융합율(融合率)이 3~7% 감소(減少)하지만 binucleate의 유도(誘道)에 유효(有效)한 것으로 추정(推定)된다.

Solanum melongena var. fructualbo 품종(品種)을 이용(利用)해서 원형질체 유리(遊離)에 미치는 여러 가지 요인(要因)을 규명하여 원형질체를 배양(培養)하여 금후(今後) 유용(有用)한 체세포잡종식물의 획득(獲得)에 필요한 기초자료로 활용하고자 실험(實驗)하였다. CPW 무기염이 함유(含有)된 0.7M mannitol 용액(溶液)에 1시간(時間)동안 전처리(前處理)한 후(後) cellulase 1.5%, macerozyme 0.2%, mannitol 0.6M, MES 0.01M, BSA 0.2%, pH 6.3에서 4시간(時間) 배양(培養)한 것이 원형질체 수량(收量) 및 상태(狀態)가 가장 양호(良好)하였다. 수세용액내(水洗溶液內) mannitol 농도(濃度)는 0.7M에서, sucrose 농도(濃度)는 0.6M로 하여 ESSCC방법(方法)으로 회수(回收)하는 것이 건전하고 안정(安定)된 원형질체 대량획득(大量獲得)에 적합하였으며, 거의 최적조건을 이용(利用)하여 처리(處理)된 원형질체를 의 밀도(密度)로 8P-KM배지(培地)에 배양(培養)했을 때 3~5일(日)부터 세포신장(細胞伸長)을 하였고, 그 이후(以後)부터 세포분열(細胞分裂)이 이루어져 10일(日) 후(後)부터 colony 형성(形成)이 관찰되었다.

감자의 엽육조직(葉肉組織)으로부터의 원형질체(原形質體) 분리(分離)에 있어서 최적생육환경(最適生育環境), 적정효소(適正酵素) 농도(濃度), 적정효소(適正酵素) 처리시간(處理時間) 및 순수분리(純粹分離)를 위(爲)한 적정(適正) sucrose의 농도(濃度)를 밝히고 감자 및 petunia의 세포융합(細胞融合)에 있어서 PEG의 분자량(分子量), 농도(濃度) 및 처리시간(處理時間) 그리고 DMSO의 첨가(添加) 효과(效果)를 밝히기 위(爲)해 수행(遂行)되었다. 원형질체(原形質體) 분리(分離)에 있어서 생육환경(生育環境)은 고습도(高濕度), 낮은 조도(照度)에서 생육(生育)된 엽육조직(葉肉組織)이 유리(有利)하였으며 pectolyase Y-23 효소(酵素)가 기내배양(器內培養)된 엽(葉)에서 원형질체(原形質體) 분리시(分離時) 좋은 효과(效果)를 나타내었다. Cellulase의 농도(濃度)는 2%(W/V)가 좋았으며 효소처리(酵素處理) 시간(時間)은 3~4시간(時間)이 좋았고 원형질체(原形質體)의 순수분리(純粹分離)는 감자의 경우(境遇) 0.4~0.5M sucrose가 효과(效果)가 좋다. 원형질체(原形質體)의 융합(融合) 시(時) 처리시간(處理時間)은 공히 30분(分)이 적당(適當)했으며 PEG의 분자량(分子量), 농도(濃度)가 높을수록 융합율(融合率)이 높았다. 감자의 두 품종간(品種間) 융합(融合)이나 감자와 petunia의 융합(融合)에 있어서도 역시 PEG의 분자량(分子量), 농도(濃度)가 높을수록 높았다. Dimethyl sulfoxide의 첨가(添加) 효과(效果)는 DMSO를 5%에서 10%첨가(添加) 시(時), 감자와 petunia의 융합(融合)에서 2~4% 융합율(融合率)이 증가(增加)되었다.

The most important factor in breeding program is to obtain the value-added genetic line. Generally, breeders develop genetic sources using several methods such as segregation-breeding, cross-breeding, backcross-breeding, mutation induction, tissue culture and so on. Here, we present one classical way but very valuable method called cell fusion or protoplast fusion to create genetic sources for the breeding practice. The method we developed was the asymmetric somatic-hybridization of protoplast isolated from carrots. This is rather to transfer the nucleus from the high quality F1 hybrid to other mediocre line to produce a new carrot line. Since the breeding a carrot line for higher quality and purity takes a long time, therefore this nuclear transfer technology is very beneficial to generate a new line that could be useful to breed elite varieties. We had obtained around 200 fused carrots (cybrids), 12 cybrids were self pollinated and produced seeds. Selected progenies (C3) have been evaluated for horticultural characteristics and we have found new genetic lines that show better phenotypes.

The most important factor in breeding program is to obtain the value-added genetic line. Generally, breeders develop genetic sources using several methods such as segregation-breeding, cross-breeding, backcross-breeding, mutation induction, tissue culture and so on. Here, we present one classical way but very valuable method called cell fusion or protoplast fusion to create genetic sources for the breeding practice. The method we developed was the asymmetric somatic-hybridization of protoplast isolated from carrots. This is rather to transfer the nucleus from the high quality F1 hybrid to other mediocre line to produce a new carrot line. Since the breeding a carrot line for higher quality and purity takes a long time, therefore this nuclear transfer technology is very beneficial to generate a new line that could be useful to breed elite varieties. We had obtained around 200 fused carrots (cybrids), 12 cybrids were self pollinated and produced seeds. Selected progenies have been evaluated for horticultural characteristics and we have found new genetic lines that show better phenotypes.