본 연구에서는 Flammulina velutipes var. lupinicola의 laccase 유전자를 동정하고 최적 활성 pH, 온도, 시간을 분석하고 하였다. F. velutipes var. lupinicola 유전체에서 선별된 laccase 유전자 서열을 바탕으로 구리 결합 부위 및 신호 펩타이드 분석을 수행한 결과 5종의 laccase 유전자(g1934, g1937, g2415, g2539, g5858)를 동정하였다. 5종의 선별된 laccase 유전자 크기는 1,488~1,662 bp로 확인되었고, cDNA 염기서열 분석 결과 14~17개의 인트론이 확인되었다. Laccase 유전자의 신호펩타이드로 예측된 절단 부위는 N-말단으로부터 20~34 bp 사이에 위치하는 것으로 확인되었다. F. velutipes var. lupinicola laccase의 활성 특성을 규명하기 위해 분리 정제를 수행하였으며, Zymogram을 수행하여 0.2 M 및 0.3 M NaCl과 1.6 M 및 1.7 M의 ammonium sulfate로 정제된 단백질에서 5개의 laccsae 활성 밴드를 확인하였다. pH, 온도 및 시간별로 분리 정제된 단백질의 최적 활성을 분석한 결과, 반응의 최적 pH는 5.5이고 최적 온도는 40 ̊C로 확인되었다. 따라서 본 연구를 통하여 확인된 F. velutipes var. lupinicola 유전체의 laccase 유전자 구조 및 활성에 대한 특성은 laccase를 이해하는 데 도움이 될 것이며 추가 연구를 통하여 향후 다양한 산업적 활용이 가능할 것으로 사료된다.

최근 Flammulina 종들에 대한 유전체 염기서열 분석 결과가 보고되었고, 그로 인해 다양한 유전자 정보가 밝혀지고 있다. 본 연구에서는 Flammulina elastica 전체 유전체 서열의 laccase 유전자를 동정하고 구조적 특징 분석을 수행하고자 하였다. 유전체 분석 및 생물정보분석을 통하여 F. elastica 유전체 내 3개의 laccase 유전자(Felac1, Fe-lac2, Fe-lac3)를 확인하였고, 이들 유전자 내에는 10개의 히스티딘 잔기와 1개의 시스테인 잔기를 가지는 구리 이온 결합 영역과 4개의 시스테인 잔기를 가지는 이황화결합 형성 부위가 존재하는 것을 확인하였다. 1,548~1,602 bp의 laccase 유전자에 대한 전장 cDNA 염기 서열 분석을 통하여 12~16개의 인트론이 존재하는 것을 확인되었으며, N-말단으로부터 17~22 bp의 사이에 신호 펩타이드가 존재하는 것이 확인되었다. 본 연구를 통하여 F. elastica의 laccase 유전자를 최초로 동정하여 구조적 특징을 분석하였고, 이러한 결과는 F. elastica의 바이오매스 분해에 대한 이해를 돕는데 활용될 것으로 사료된다.

Pleurotus eryngii has recently become a major cultivated mushroom; it uses tetrapolar heterothallism as a part of its reproductive process. Sexual development progresses only when the A and B mating types are compatible. Such mating incompatibility occasionally limits the efficiency of breeding programs in which crossing within loci-shared strains or backcrossing strategies are employed. Therefore, understanding the mating system in edible mushroom fungi will help provide a short cut in the development of new strains. We isolated and identified pheromone and receptor genes in the B3 locus of P. eryngii and performed a functional analysis of the genes in the mating process by transformation. A genomic DNA library was constructed to map the entire mating-type locus. The B3 locus was found to contain four pheromone precursor genes and four receptor genes. Remarkably, receptor PESTE3.3.1 has just 34 amino acid residues in its C-terminal cytoplasmic region; therefore, it seems likely to be a receptor-like gene. Real-time quantitative RT-PCR (real-time qRT-PCR) revealed that most pheromone and receptor genes showed significantly higher expression in monokaryotic cells than dikaryotic cells. The pheromone genes PEphb3.1 and PEphb3.3 and the receptor gene PESTE3.3.1 were transformed into P5 (A3B4). The transformants were mated with a tester strain (A4B4), and the progeny showed clamp connections and a normal fruiting body.

목 적: 콘택트렌즈의 부작용으로 감염성 각막염이 의심되는 환자에서 분리한 균주들을 동정하고, fluoroquinolone 항생제 내성균주를 감별하여 내성기전에 관여하는 gyrA 유전자를 분석해 내성의 원인을 알아보고자 한다. 방 법: 감염성 각막염이 의심되는 기질성 침입 환자 30명을 대상으로, 각막에서 분리한 균주를 Ofloxacin(5㎍/㎖), Ciprofloxacin(5㎍/㎖), Levofloxacin(5㎍/㎖) 항생제 배지에 배양하여 16S rRNA gene PCR 방법으로 동정하였다. 디스크 확산법으로 내성균주를 감별하고, genomic DNA를 추출하여 PCR를 통 해 증폭한 후 gyrA QRDR 부위의 유전자를 분석하였다. 결 과: Ofloxacin이 첨가된 배지에서 배양된 균주는 Achromobacter xylosoxidans (N101, N102), Staphylococcus epidermidis (N105)로 동정되었고, Ciprofloxacin이 첨가된 배지에서 배양된 균주는 Achromobacter xylosoxidans (N101, N102), Staphylococcus epidermidis (N103, N104, N105, N106), Staphylococcus warneri (N107), Staphylococcus hominis (N108), Staphylococcus saprophyticus (N109), Alcaligenes sp.(N110)로 동정되었다. 항생제 디스크 확산법으로 Staphylococcus epidermidis (N105)는 Ofloxacin에 내성, Ciprofloxacin과 Levofloxacin은 중간내성으로 나타났으며, gyrA 유전자의 분 석 결과 QRDR부위에서 Ser(TCT)84 →Phe(TTT)으로 아미노산 변이가 관찰되었다. 결 론: 감염성각막염 의심환자 각막에서 그람양성균 7균주, 그람음성균 3균주가 동정되었다. fluoroquinolone 항생제 감수성 검사에서 내성균주가 나타났으며, gyrA 유전자의 codon 84 부위에서 아미 노산 변이가 나타나 내성에 영향을 미치고 있다는 것을 확인할 수 있었다. 향후 항생제의 지속적인 사용으로 많은 내성균주들이 나타날 것이라 예측되며 fluoroquinolone 항생제를 사용할 때 내성에 대한 주의가 필요 할 것으로 생각된다.

본 연구는 최근 북한강 수계에서 번성하고 있는 Anabaena strain의 16S rDNA 염기서열을 이용한 종 수준의 동정과 geosmin 합성 유전자의 탐침을 통해 이취미 물질의 잠재 생산능력을 분석하였다. 현장(경기도 양평군 조암면 삼봉리 수역)에서 분리 배양한 Anabaena는 직선형과 나선형 두 가지의 형태적 변이를 보였다. 이들은 세포의 크기와 사상체에서 형태적 차이를 나타냈으며, A. circinalis 및 A. crassa와 유사한 형태적 특징들을 보여주었다. 그러나 16S rDNA 계통수 및 유연관계를 분석한 결과, 직선형과 나선형 모두 동일한 A. circinalis 종으로 확인되었다(98%~100%의 유전적 유사도). 또한 직선형과 나선형 strain 모두에서 geosmin을 합성하는 유전자 구간이 발견되어, 북한강 수계에 존재하는 Anabaena circinalis는 종의 형태적 변이에 관계없이 geosmin을 생산할 수 있음을 보여주었다. 본 연구의 결과는 유전자 수준에서 A. circinalis의 geosmin 생산에 대한 직접적인 증거를 제공하는 국내 최초의 보고로서 북한강 수계에서 geosmin 증가의 원인종 확인 및 관리에 중요한 자료를 제공한다.

Tenebrio 모델은 Tribolium과 비교하여 실험실에서 배양 및 조작하기가 쉬운 생물 종이다. 하지만 현재까지는 해독되어진 유전체 정보가 그리 많지 않다. Mycoplasma genus는 세포벽이 없으며 사람에서 pneumonia 나 다른 호흡기 질환을 일으키는 박 테리아로 본 연구에서는 갈색거저리 유충을 이용하여 Mycoplasma genus와 유사 한 acholeplasma lysate를 처리하여 접종 전과 후의 비교 전사체학적 방법을 통하여 선천성 면역 관련 유전자들을 동정하고 기능 분석을 위한 기초 데이터를 확보 하고 자 하였다. 갈색거저리 유충에 acholeplasma lysate를 처리하기 전과 후의 각 샘플 들로부터 cDNA library를 구축한 후 random sequencing 을 통해 해독 되어진 염기 서열들을 비교 분석 하였다. 얻어진 서열들로부터 NCBI nr 데이터베이스에 Blastx 분석을 하여 획득한 서열들을 생물정보학적 방법을 이용하여 비교한 결과, 곤충의 선천성면역(innate Immunity)에 중요한 것으로 알려진 serpin 관련 유전자들이 약 5종류 동정되었다. Serpin (XP_974209.1) 의 경우 acholeplasma에 처리하여 전과 후 비교하였을 때, 약 3배 정도 증가를 나타내었고, serpin 6 (XP_972660.1)의 경우 에는 acholeplasma를 처리한 샘플에서만 동정되었다. 또한 serpin 3a (XP_969874.1), serpin 1(BAI59109.1), serpin 40(BAI59106.1) 등의 유전자들도 동정되었다. 추후 이러한 유전자들을 대상으로 한 기능연구를 통하여 보다 구체적인 면역기능을 구 명하고자 한다.

Serine protease는 병원체의 표면 melanization, hemolymph coagulation, antimicrobial peptide synthesis 등을 통해 여러 무척추동물의 방어기작을 조절하는것으로 알려 져 있다. 곤충의 경우 Tribolium을 대상으로 이와 같은 연구가 이루어져 왔지만, 혈 액의 량이 그리 많지 않아 연구자들은 최근 갈색거저리(Tenebrio)를 이용하기 시작 하였다. 하지만 아직 유전체(자) 서열정보가 충분하지 않은 상황이다. 본 연구에서 는 이러한 갈색거저리 유충을 이용하여 세포벽이 없으며 사람에서 pneumonia나 다른 호흡기 질환을 일으키는 mycoplasma 와 유사한 acholeplasma lysate를 처리 한 후 접종 전과 후의 전사체의 비교를 통하여 무척추 동물에서의 선천성 면역 관련 유전자들을 동정하고자 하였다. Acholeplasma lysate를 처리하기 전과 후의 각 샘 플들로부터 cDNA library를 구축한 후 random sequencing 을 통해 염기서열을 분 석하였고, 얻어진 서열들로부터 NCBI nr 데이터베이스에 Blastx 분석을 하여 획득 한 서열들을 comparative transcriptomic 방법을 이용하여 분석한 결과, 여러 종류 의 Serine protease 관련 유전자들이 동정되었다. Serine protease (XP_970766.1)의 경우에는 acholeplasma를 처리한 샘플에서 2배 정도 발현이 증가하였고, serine protease P66 (EFA09207.1)의 경우 증감의 변화는 보이지 않았다. 또한 serine protease P146 (EFA04636.1), serine protease H1 (EEZ99180.1) 등의 유전자들도 동정되어 연구하고 있다.

소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 매개충인 솔수염하늘소 (Monochamus alternatus)와 북방수염하늘소 (Monochamus saltuarius)는 생물학적 뿐만 아니라 형태적으로도 비슷하다. 특히, 유충의 형태를 육안으로 구별하기가 용이하지 않다. 우리가 디자인한 Intermal transcribed spacer(ITS) 유전자 마커를 이용하여 지역별 로 매개충들의 분포를 알아보았다. 개발한 ITS primer는 PCR을 통하여 유전자 마 커로서의 기능을 확인하였고, 이 실험을 입증하기 위하여 실험에 사용했던 유충들 을 성충으로 사육한 결과 PCR 실험과 같은 결과를 나타낸 것을 확인하였다. 이러 한 ITS PCR method를 이용하여 지역별 매개충 분포를 조사하였다. 소나무재선충 병 피해지에서 매개충 유충을 채집하여 PCR을 실행하였다. 그 결과 경기도는 북방 수염하늘소, 대구는 솔수염하늘소, 충남과 경북은 솔수염하늘소와 북방수염하늘 소가 혼생되어 있는 것을 확인하였다. 더 나아가 이 방법을 이용하여 신규발생지역 에서 나타난 매개충의 종류를 유충상태에서 미리 파악이 가능하며, 두 매개충이 혼 생하는 지역을 확인하여 예방 및 방제를 할 수 있을 것이라 생각된다.

버섯 재배기술이 발전하여 느타리와 큰느타리의 전체 생산 및 소비가 버섯전체생산의 약 50%를 차지하여 재배품종의 주류를 형성하고 있다. 하지만 UPOV 및 FTA 등의 문호개방에 따라 로열티 지불 등에 대응할 수 있는 품종육성이나 자체 고유품종 육성을 위한 신기술개발이 시급한 실정이다. 본 연구에서는 품종육성의 기초기반 연구로 느타리버섯의 12,342 ESTs 분석을 통하여 세포막의 구성물질인 ergosterol 생합성관련 유전자 동정을 한 결과 12개의 유전자 중에서 9개가 동정되어 이에 대한 발현 분석 중이며, 느타리버섯의 부가가치에 가장 중요한 멜라닌 색소 유전자가 아직까지 동정되지 않아 집중적으로 분석한 결과 Tyrosine 생합성대사관련 유전자인 DOPA 4,5-dioxygenase가, 그리고 Acetate 생합성대사 관련유전자 THR1 (1,3,8-Trihydroxynaphthalene reductase)이 동정되어 느타리버섯의 멜라닌 생합성에는 하나의 대사기작이 아닌 복합기작에 의해 색소를 생성함을 유추할 수 있었다.

사체의 사후경과시간을 추정하는데 사체에 출현하는 검정파리과 곤충을 이용할 때 파리 종의 정확한 동정이 요구된다. 최근 미토콘드리아DNA(mtDNA)의 염기서열이 종의 동정에 많이 이용되고 있으며, COI-II 유전자 부위는 상대적으로 염기서열 변화가 많기 때문에 종간의 분류를 위한 마커로 적합하다고 알려져 있다. 본 연구에는 부산에서 채집된 검정파리과에 속하는 파리들의 mtCOI의 염기서열을 분석하고, GenBank에 등록된 종들과 비교하였다. COI 염기서열의 한 부분을 증폭하여, 염기서열들을 398 bp 크기로 정렬하였다. 전체 34종의 계통수에서 Lucilia 와 Calliphora 속 사이는 확연한 계통학적 분리가 나타났지만, 동일 속내 일부 종 사이에서 계통학적 거리가 나타나지 않았다. 계통수에서 C. stygia 와 C. albifrontails, C. augur 와 C. dubia, L. cuprina와 L. sericata 및 L. caesar 와 L. illustris 사이에서는 혼합된 집락이 나타났다. 전제 34종 가운데 표본이 1개체뿐인 종을 제외한 16종에서 종내 염기서열 변이도를 조사한 결과 ~ 0.044까지의 종내 염기서열변이도를 나타내었으며, 종 내의 염기변이결과로 각 종에 따라 1 ~ 17개의 haplotype 이 관찰되었다. 동일 종 내에서 다양한 haplotype이 보임으로서 종의 동정에 이용될 수 있는 염기서열의 정보가 매우 제한적임이 시사되었다. 다양한 지역에서 다수의 개체를 이용한 연구를 통하여 각 종들에 대한 종내 변이의 범위를 확인하는 연구가 필요할 것으로 사료된다.

I. purpurea의 야생형 FP39는 진한 자주색 꽃과 흑 갈색의 종자가 맺히는 반면, 자연변이종인 KK-1과 W-4는 안토시아닌 색소가 결핍된 꽃을 피우고 아이보 리색의 종자를 맺는다. 이들 변이종에서는 조사된 안토 시아닌 생합성 유전자의 발현률이 떨어졌는데, 이는 나 팔꽃식물의 전사조절인자 변이종인 ivs, c1 및 ca 계 통에서 관찰된 결과와 유사하였다. 분자분석을 통해 꽃 과 종자에서 동시에 관찰되는 착색변이는, bHLH 단 백질을 암호화하고, 꽃과 종자의 착색을 포함한 식물의 표피세포에서 나타나는 여러가지 형질에 관여하는, 애 기장대의 TT8과 페튜니아의 AN1유전자와 상동성이 있 는 나팔꽃의 IVS 유전자에 DNA형 전이인자가 삽입됨 으로써 유전자의 기능이 상실된 결과였다. KK-1과 W-4계통은 bHLH2의 변이형질인 ivs-m1과 ivs-stb를 각각 가지는데 두 대립형질의 IVS 전사산물 축적은 전이인자의 exon 영역 삽입에 의해 감소되었다. 전이 인자의 삽입을 제외하더라도, ivs-m1과 ivs-stb는 exon 및 intron 영역에서 각각 26 및 165부분에서 DNA 염기서열 차이를 보였다. 그 차이는 추정 아미노산 서 열에서14개의 아미노산 차이로 나타났는데, 이러한 결 과로 이 두 대립형질이 같은 종 내에서 서로 다른 생 태역사를 가질 것이라는 것을 알 수 있다.

In order to unravel unidentified genes from human salivary gland, a cDNA library of human submandibular gland was constructed in the Uni‐ZAP XR vector by use of mRNA from human submandibular gland and ZAP‐cDNA® Gigapack® III Gold Cloning Kit. cDNA of salivary gland was subtracted with cDNA of immortalized human keratinocyte cell line, Rhim Human Epithelial Keratinocyte cell line. The phage cDNA library was converted into a pBluescript phagemid cDNA library, which was subsequently plated on LB plates with ampicillin, IPTG, and X‐gal, and white colonies were selected for sequencing. Among 200 clones analyzed, four clones containing C77‐091, C75‐014, C76‐022, and C76‐012 designated orphan genes that are intensely expressed in the interlobular ductal and serous acinar cells of human submandibular gland. Particularly C77‐091 gene expresses 46 amino acids peptide (pI=9.45). C75‐014 and C76‐022 genes were characterized as those expressing excretory basic proteins primarily consist of alanine, proline, and leucine residues, mimicking a basic proline‐rich protein (bPRP) showing helical structures and having multiple consensus sequences of phosphorylation sites. The strong expression of C76‐012 mRNA in the nuclei of salivary ductal and acinar cells suggests a role of C76‐012 gene as a DNA binding RNA/protein. These data suggest that the identification of four orphan genes from the human salivary glands may add further understanding of greater role of salivary proteins providing innate immunity by protecting and stabilizing the mucosal epithelium in the maintaining homeostasis of oral mucosa.

버섯의 품종육성을 위해서는 종간 및 종내의 다른 두 개의 단포지를 분리하여 교배한 후 우량형질을 선발하여 신품종으로 등록된다. 전세계적으로 25%를 재배생산되고 있는 느타리버섯은 4극성교배시스템을 가지고 있어서 이러한 교배 불화합성을 이용하면 육종 시간 및 노력을 단축할 수 있다. 느타리버섯의 교배형은 4개의 딸핵으로 분열되는 세포분열에 A형, 클램프 연결체의 형성에 관여하는 B형으로 나눈다. 최근에는 게놈프로젝트에 의해 교배기작에 관련된 유전자가 밝혀짐에 따라 이것을 이용한 육종효율 제고를 위해 많은 연구자들이 교배형 결정인자의 동정에 심혈을 기울이고 있다. 최근에는 분홍느타리(Pleurotus djamor)에서 CLA4(MAP kinase) 유전자의 CAPS 분석에 의해 교배형 B가 동정되었다. 따라서 본 실험에서는 제한효소를 사용하지 않고 바로 PCR로 동정할 수 있는 방법으로 교배형 A에 해당하는 homeodomain 유전자를 이용하여 교배형 A를 동정하였다.

In order to obtain novel genes related to the human craniofacial development, molecular cloning and sequencing, and in situ hybridization using craniofacial tissue sections were performed and followed by protein structure simulation. Totally 231 clones were obtained from the subtracted craniofacial tissue cDNA library of human embryo. Random cloning using the non-redundant clones from the craniofacial tissue of human embryo was done and obtained 398 clones from the premade human chondrocyte cDNA library. Their partial sequence data showed that 214 clones of subtracted cDNA library of craniofacial tissue were still non-redundant in Genebank search. And 20 clones among 498 clones of premade chondrocyte cDNA library were known to be undefined genes. Through in situ hybridization screening in the craniofacial tissue sections of 10 weeks old human embryo 36 clones were found to be positive in specific tissues. Depending on the cell types of sirnilar developmental origin, the positive reactions could be divided into five groups. Among the 20 clones of undefined genes from human chondrocyte cDNA library, 7 clones showed characteristic positive reaction in human cartilage tissue by in situ hybridization. From the simulated protein structure, motif analysis and in situ hybridization studies for the 7 undefined clones, Ch89, Ch96, Ch129, Ch285 clones may function in the outer space of the cell constituting a part of matrix protein complex, and Ch276 as a transmembrane protein which might partic ipate in matrix calcification around chondrocytes. Ch153 is a kind of antirnicrobial protein also acting as an inflammation mediator, and Ch334 clone is a zinc finger protein, of which expression increases in human adult tissues We presume these novel genes from human chondrocytes may provide a new path of chondrocyte development and functions of human craniofacial tissues

사과는 배우체형 자가불화합성을 나타내는데 이는 S-locus의 복대립유전자에 의해 조절된다. 본 연구는 S-allele specific PCR분석을 통해 신품종을 포함한 24종의 사과 주요 재배품종과 7종의 꽃사과 품종의 자가불화합성 유전자형(S-genotype)을 결정하고자 수행하였다. 31종의 재배품종과 꽃사과 품종 을 23종의 S-allele specific primer을 이용하여 분석한 결과 12개의 S-allele (S1, S2, S3, S5, S7, S9, S10, S16, S21, S23, S26, S29)이 동정되었다. 그 중에서 24종의 재배품종에는 S1(41.7%), S3(58.3%), S7(29.2%), S9(54.2%)의 S-allele이 흔히 존재하는 것으로 확인되었다. 국내육성 신품종인 ‘아리수’와 ‘황옥’의 S-genotype은 각각 S3S7과 S3S9으로 동정되었다. 본 실험에서 얻은 S-genotype 정보는 안정적인 사과 과실생산에 적합한 수분수 선발과 육종프로그램에서 교배조합 작성에 유용 하게 활용될 것이다.