어류양식에 있어서 사육중인 어류가 주로 받는 스트레스는 크게 인위적인 요인과 환경적인 요인으로 나눠지며, 환경적인 요인에서 수온은 어류의 성장, 번식 및 대사 등 생리적 요인을 좌우하는 중요한 변수가 된다. 특히, 급격한 수온변화는 어체의 생리조건을 변화시키거나 체내 항상성을 붕괴시켜, 스트레스로 작용하여 어류의 건강도를 저하시키는 것으로 보고되고 있다. 최근 어류양식장과 인접한 연안해역의 급격한 수온변화는 대규모 산업시설, 발전소 및 제철소 등에서 발생되는 온배수의 연안방류와 매년 불규칙적이고 광범위하게 발생하는 냉수대가 원인인 것으로 알려져 있다. 이러한 급격한 수온변화는 인근해역의 수산생물상 변화와 자원량에 영향을 미칠 뿐만 아니라, 인근 양식장에서 사육중인 어류의 건강도 저하 및 대량폐사 등 직접적인 피해를 입히고 있다. 따라서 본 연구는 온배수 및 냉수대로 인한 급격한 수온변화가 어류의 대사 및 생리활성에 미치는 영향을 파악하기 위하여 우리나라 주 양식대상종인 넙치를 대상으로 대사율과 직접적으로 관계있는 산소소비 경향을 조사하였다. 실험어는 평균전장 19.1±0.8 ㎝, 평균체중 53.8±6.3 g의 넙치를 사용하였으며, 산소소비 실험은 해수 순환여과 사육수조에서 사육하고 있는 넙치 5마리를 밀폐순환유수식 산소소비 측정 장치 내의 호흡실로 옮겨 실시하였다. 실험은 수온 20℃에서 2일간 유지 후, 시간당 0.5℃씩 각각의 실험수온(실험 Ⅰ: 29℃, 실험 Ⅱ: 11℃)으로 조절하여 4일간 유지하면서 산소소비 경향을 측정하였다. 실험기간동안 광주기(12L:12D)와 유수량은 일정하게 유지하였으며, 실험어의 호흡수는 각각의 실험수온에서 실험어의 아가미 개폐 횟수를 1분간 5회 측정 후 평균값으로 나타냈다. 실험어의 산소소비량은 실험기간동안 유입수와 유출수의 용존산소량을 이용하여 단위체중당 산소소비량(㎎ O2/㎏/h)과 호흡당 산소소비량(㎎ O2/㎏/h)으로 계산하여 나타냈다. 고수온 충격에 따른 넙치의 산소소비량은 수온이 20℃일 때 145.2±13.0 ㎎ O2/㎏/h에서 수온이 29℃로 상승하자 356.7±14.1 ㎎ O2/㎏/h로 약 2.5배 증가하였다. 이후 고수온이 유지되면 넙치의 산소소비량은 유의하게 감소하여 4일째에는 274.3±12.8 ㎎ O2/㎏/h로 나타났다. 광주기에 따른 산소소비량은 20℃에서 명기조건 141.1±14.2 ㎎ O2/㎏/h, 암기조건 148.9±11.1 ㎎ O2/㎏/h였으며, 29℃에서 명기조건 360.6±11.8 ㎎ O2/㎏/h, 암기조건 352.9±15.5 ㎎ O2/㎏/h로 광주기에 따른 산소소비량은 실험종료시까지 유의한 차이를 보이지 않았다. 저수온 충격에 따른 넙치의 산소소비량은 수온 20℃의 114.5±13.4 ㎎ O2/㎏/h에서 11℃로 하강하자 98.3±11.3 ㎎ O2/㎏/h로 약 1.2배 감소하였다. 이후 저수온이 유지되면서 넙치의 산소소비량은 점차 증가하여 4일째에는 109.7±6.4 ㎎ O2/㎏/h로 나타났다. 한편, 20℃ 명기조건 119.5±5.5 ㎎ O2/㎏/h, 암기조건 109.4±17.0 ㎎ O2/㎏/h였으며, 11℃ 도달 1일째의 명기조건 96.1±2.5 ㎎ O2/㎏/h, 암기조건 100.4±15.8 ㎎ O2/㎏/h로 광주기에 따른 산소소비량은 실험종료시까지 유의한 차이를 보이지 않았다. 이상의 결과를 종합하여 볼 때, 넙치는 수온상승 및 하강과 비례해서 산소소비량이 증가 및 감소하였으며, 광주기에 따른 산소소비량은 차이가 없었다. 또한 저수온 충격보다 고수온 충격시에 산소소비량의 변화가 급격히 나타났다.

Min et al.(2005)의 연구에서 담수사육 감성돔, Acanthopagrus schlegeli의 성장과 생존율이 해수사육 감성돔에 비해 다소 높았으며, 병적 증상이 나타나지 않았던 점을 고려해 볼 때, 담수환경은 감성돔의 생리상태에 그다지 영향을 미치지 않은 것으로 논의된 바 있다. 강도다리의 경우, 저염분 순화시 생리적 반응에 관한 연구(Kim et al., 2009)가 이루어져 저염분 사육이 가능할 것으로 기대되고 있으며, 현재 제주도에서 지하해수를 이용하여 양식이 시도되고 있다. 그러나 강도다리의 염분변화에 따른 생리적 반응만 단기간 조사한 연구결과를 양식현장의 사육관리 기술에 적용하는 것은 무리가 있다. 이에 따라, 본 연구에서는 해수어류인 강도다리의 성공적인 저염분 양식기법 개발에 관한 기초자료를 얻기 위하여, 4개 염분조건에서 장기간 사육하면서 스트레스 반응, 생존율 및 성장률을 비교하였다. 300ℓ의 유수식 원형사육수조에 0, 10, 20 및 35 psu로 염분을 맞추어 각각 20마리씩의 강도다리를 수용하여 90일간 3반복으로 사육하였다. 각 염분에 있어서 실험어의 체중±표준편차는 266.6±0.4, 267.1±0.4, 266.6±0.2 및 266.8±0.5 g이었다. 수온은 15∼16℃를 유지하였으며, 사육수는 1일 20회 환수되도록 유수하였다. 사료는 1일 어체중의 2%를 3회로 나누어 공급하였다. 혈액은 실험개시시, 30, 60 및 90일째에 채취하였다. 채혈은 heparin sodium을 처리한 주사기(3 ㎖)을 사용하였으며, 각 실험수조에서 5마리 씩 30초 이내에 채혈하였다. 채취한 혈액을 원심분리(5,600×g, 5분)하여 얻은 혈장은 분석전까지 초저온 냉동고(－72℃)에 보관하였다. 혈장의 cortisol 농도는 Donaldson (1981)의 방사면역측정법(RIA)에 따라 cortisol RIA kit (DSL, USA)로 항원과 표지항원이 항체에 경쟁적으로 반응하도록 유도한 다음, Hewlett Packard Gamma Counter (Cobra Ⅱ 5010, Packard Co., USA)로 측정하였다. 혈장 글루코스 농도를 분석하기 위하여 생화학 자동분석기(Advid 1650, JEOL Co., Japan)를 사용하였다. 각 실험구의 강도 다리 성장도는 30일 간격으로 조사하였으며, 전장은 버니어켈리퍼스를, 체중은 전자저울을 이용하여 1/10 g까지 습중량으로 측정하였다. 실험기간중 각 실험구에서 매일 폐사개체를 파악하여 폐사율을 구하고, 이로부터 생존율을 역산하였다. 실험개시시 혈장 cortisol 농도는 0 psu 6.2±2.0 ㎍/㎖, 10 psu 9.2±3.5 ㎍/㎖, 20 psu 7.7±1.4 ㎍/㎖, 35 psu 10.4 ±1.7 ㎍/㎖였다. 10, 20, 35 psu에서는 실험종료시까지 유의한 차이가 없었으나, 0 psu에서는 실험개시후 30일째에 116.5±19.2 ㎍/㎖, 60일째에 168.4±15.6 ㎍/㎖로 꾸준히 증가하는 경향을 나타내었으며, 90일째에 67.4±11.8 ㎍/㎖로 다시 낮아지는 경향을 나타내었다. 이는 0 psu에서 사육한 강도다리가 비록 실험종료시에 cortisol 농도가 다소 낮아지는 경향은 나타내긴 하였지만, 90일간 연속적인 염분스트레스를 받아 이온평형에 영향을 받았을 것으로 판단된다. 글루코스는 실험개시시부터 종료시까지 유의한 차이가 나타나지 않았다. 각각의 염분에서 사육한 강도다리의 체장은 실험개시시 21.1±0.7 ㎝, 21.2±0.5 ㎝, 21.2±0.9 ㎝ 및 21.3±0.5 ㎝에서 실험종료시 21.8±0.1 ㎝, 22.8±0.4 ㎝, 23.1±0.3 ㎝ 및 22.7±0.4 ㎝로 성장하였다. 체중은 실험개시시 266.6±0.4 g, 267.1±0.4 g, 266.6±0.2 g 및 266.8±0.5 g에서 실험종료시 257.1±8.3 g, 328.6±14.3 g, 353.1±2.2 g 및 367.9±9.8 g으로 자라남으로써, 0 psu에서 사육한 강도다리를 제외한 나머지 실험구 모두에서 실험개시시보다 체중이 증가하였다. 실험종료시 모든 실험구에서 생존율은 100%로 폐사한 개체는 없었다.

최근 강도다리의 우수한 삼투압조절 능력을 이용하여, 염분변화시 강도다리의 생리적 반응에 관한 연구(Kim et al., 2008)가 이루어지고 있으며, 지하해수를 이용한 양식이 시도되고 있다. 그러나 지하 해수 사용이 가능한 제주도를 제외한 동해안과 남해안 지역에서는 발전소 및 조선소 등의 온배수에 의해 급격한 수온상승이 일어나거나, 냉수대로 인해 수시로 수온 급강하 현상이 발생한다. 또한 담수역에 가까운 곳일 경우, 담수의 유입이나 장마철 폭우로 인해 염분변화가 일어날 수 있다. 이러한 급격한 수온변화와 염분변화는 사육중인 강도다리에 스트레스로 작용하여, 어체의 성장, 번식, 대사, 삼투압조절 등 어류의 생리적 변화를 유발시켜 양식 생산성에 영향을 끼칠 가능성이 높다. 그러므로 본 연구는 담수와 해수에서 적응시킨 강도다리를 사용하여 급격한 수온변화에 따른 생리적 반응에 관한 기초자료를 얻고자 실시되었다. 220ℓ의 지수식 원형 사육수조에서 해수(34 psu)로 사육 중인 강도다리 치어(평균체장: 15.4±1.2 ㎝, 체중: 76.9±18.2 g) 112마리 중 55마리는 담수순화시켜 담수에 수용하고 나머지 57마리는 해수에 두었다. 담수와 해수에서 사육한 강도다리를 자동수온조절시스템(JS-WBP-170RP, Johnsam Co., Korea)이 부착된 40ℓ사각수조에 각각 50마리씩 수용하였으며, 24시간 안정시켰다. 이후 수온을 1℃/day로 30℃까지 수온을 상승시키고, 10℃까지 수온을 하강시켰다. 실험어로부터 heparin sodium 처리 주사기(1 ㎖)를 사용하여 마취없이 미부혈관에서 30초 이내에 혈액을 채취하였다. 실험어로부터 혈액을 채취하기 이전에 공급한 먹이가 어체의 혈액성상에 미치는 영향을 최소화하기 위하여 채혈 24시간전부터 절식시켰다. 혈액은 수온상승시 20, 25, 30℃에서, 수온하강시 20, 15, 10℃에서 각각 채취하였다. 원심분리(5,600×g, 5분)하여 얻은 혈장은 분석전까지 －72℃에 보관하였다. 혈장의 cortisol 농도는 Donaldson (1981)의 방사면역측정법(RIA)에 따라 cortisol RIA kit (DSL, USA)로 항원과 표지항원이 항체에 경쟁적으로 반응하도록 유도한 다음, Hewlett Packard Gamma Counter (Cobra Ⅱ 5010, Packard Co., USA)로 측정하였다. 혈장 글루코스, Na+, K+, Cl－ 농도분석을 위하여 생화학자동분석기 (Advid 1650, JEOL Co., Japan)를 사용하였다. 혈장 삼투질농도는 micro-osmometer (3MO plus, Advanced Instruments Inc., USA)를 사용하여 분석하였다. 실험기간중 담수와 해수에서 혈장 cortisol 농도는 실험개시시인 20℃에서 12.0±3.1 ㎍/㎖와 12.5±1.8 ㎍/㎖였다. 20℃에서 10℃까지는 유의한 차이가 나타나지 않았지만 30℃에서 담수와 해수강도다리 모두 93.6±4.4 ㎍/㎖와 87.0±2.8 ㎍/㎖로 급격히 증가하는 경향을 나타내었으며, 해수에 비해 담수강도다리에서 유의하게 높은 값을 나타내었다. 혈장 글루코스 농도는 실험개시시 담수와 해수강도다리에서 각각 33.2±3.8 ㎎/㎗와 35.1±3.8 ㎎/㎗였다. 20℃에서 10℃의 경우, 담수에 비해 해수강도다리에서 유의하게 높았으나, 20℃에서 30℃까지는 유의한 차이를 나타내지 않았다. 담수강도다리의 글루코스 농도는 cortisol과 같이 30℃에서 급격히 증가하는 경향을 보였으나, 해수강도다리의 글루코스 농도는 20℃에서 10℃로 수온이 낮아 질수록 유의하게 증가하고 30℃로 증가할 때는 cortisol과 같이 급격히 증가하는 경향이 나타났다. 혈장 Na+ 농도는 실험개시시 담수강도다리 97.1±2.5 mEq/ℓ, 해수강도다리 122.6±10.3 mEq/ℓ로 실험기간 중 유의한 차이를 보이지 않았다. 그러나 담수에 비해 해수강도다리에서 유의하게 높은 값을 보였다. 혈장 K+ 농도는 담수강도다리에서 3.0±0.1 mEq/ℓ, 해수강도다리에서 3.2±0.2 mEq/ℓ였으며, 실험기간 중 유의한 차이는 나타나지 않았다. 혈장 Cl－ 농도는 담수강도다리에서 99.9±4.7 mEq/ℓ, 해수강도다리에서 106.7±4.3 mEq/ℓ였으며 Na+와 K+의 결과와 동일하였다. 담수와 해수강도다리 삼투 질농도는 담수강도다리에서 280.8±8.3～286.2±11.2 mmol/㎏으로 337.3±6.3～350.4±5.2 mmol/㎏의 해수강도다리보다 낮게 나타났다. 그러나 수온별 삼투질농도는 모든 실험구에서 유의한 차이가 없었다.

최근 들어 국민소득의 증가와 여가시간이 늘어나면서 애완동물 산업이 급속히 발전하고 있다. 그 중 대표적 애완동물 산업인 관상어 산업의 총 가치는 전 세계적으로 150억 달러에 달하며, 1990년대 이후로 꾸준히 증가하고 있는 추세이다. 이중 담수관상어 산업은 90% 이상이 인공생산으로서 안정되어 있는 반면, 해수관상어 산업은 특정 어종의 대량 포획에 따른 개체수 감소 및 멸종위기, 포획방법에 따른 어종의 스트레스, 주변 환경파괴 등과 같은 문제점을 가지고 있어서 인공종묘 생산기술 개발이 절실하다. 이에 따라 국내에서 일부 해수관상어를 인공번식시킨 바 있으나 더 많은 연구가 필요한 실정이다. 본 연구에서는 관상어로 잘 알려진 cinnamon clownfish(이하 clownfish라 함)의 산란 행동과 자․치어발달에 대해 조사함으로써 해수관상어종의 번식에 관한 기초자료를 얻고자 하였다. 수온 27.0±0.9℃, 염분 31 psu에서 사육한 clownfish 어미는 평균 월 1～2회 산란하였고 최대 월 4회 산란하였다. 산란시기가 다가오면 3～5일 전부터 알을 부착시킬 기질 주변을 깨끗이 청소하였다. 산란시간은 오전 9～10시 사이였으며, 산란 직전에는 기질 표면의 이물질을 입으로 뜯어내듯이 입의 개폐활동을 한 후 주변의 이물질들을 배와 꼬리지느러미로 물살을 일으켜 청소하였다. 청소를 끝마치기 앞서 암컷의 항문에는 산란관이 미리 돌출되어 있었고 청소를 끝마침과 동시에 산란기질에 알을 부착시킬 점액질을 분비하였다. 암컷이 점액질을 부착시키면 수컷은 입과 배를 이용하여 점액질을 기질에 고루 바르는 듯한 행동을 하였다. 10～15분에 걸쳐 점착기질을 만든 암컷은 즉시 산란을 하였으며 수컷은 뒤따라 방정하였다. 산란 및 방정은 30～40분 소요되었으며, 주로 수컷이 수정란 주변을 돌면서 수정란을 보호하였다. 수정란은 타원형의 침성부착란으로서 연한 오렌지 색깔이었다. 크기는 장경 2.37±0.09 ㎜, 단경 0.94±0.91 ㎜이며, 세포질에 다양한 크기의 유구가 관찰되었다. 난발생은 수정 후 1시간째에 배반이 형성되었고, 1.6시간이 지나서 2세포기로 이행하였다. 3.0시간이 경과하면서 제 2난할이 일어나 4세포기를 거쳐 상실기, 포배기, 낭배기는 각각 9.0, 10.8, 19.3시간째에 보였다. 수정 후 26.6시간째에 배체가 출현하였고 46.0시간째에 머리에 안포와 이포가 형성되었다. 70시간 경과 후 심장박동이 관찰되었으며, 초기 심장 박동수는 분당 160회였다. 수정 후 120.0시간째에는 혈액이 움직였고 근절의 일부 마디에는 황색소포가 관찰되었다. 이후는 부화 직전의 상태로서 배체가 알속을 채웠으며 안구는 흑화되었다. 부화까지 소요된 시간은 수정 후 168.0시간째였으며, 부화율은 89.5%였다. 갓 부화한 자어의 크기는 3.5±0.3 ㎜로 흑색색소포가 주로 두부의 위쪽 그리고 복부와 척추사이를 따라 분포하다. 그리고 등쪽에서 꼬리 부분을 향하여 비교적 옅은 흑색색소포가 관찰되었다. 황색색소포는 코와 눈을 지나서 등쪽에 주로 분포하였다. 부화 후 15일째 전장 10.1±0.2 ㎜였고 대부분 자어의 머리 및 등의 줄무늬가 선명하였다. 등 줄무늬는 등지느러미가 시작되는 부분에서 항문방향으로 있었다. 부화 후 30일째 전장은 13.1±0.4 ㎜였다. 눈 뒤쪽부터 꼬리의 흰 줄무늬 부위까지 진한 고동색이었고 눈 앞쪽과 각 지느러미는 주황색이었다. 부화 후 60일째 전장은 23.0±0.3 ㎜였고, 몸통의 색깔이 다소 어두운 주홍색이었다. 90일 째 자어의 전장은 41.0±0.3 ㎜로 두부의 흰줄무늬를 제외한 나머지 줄무늬는 완전히 사라졌다.

본 연구는 농어, Lateolabrax japonicus에서 Carbonic anhydrase Ⅲ (CA Ⅲ)의 발현 양상을 관찰하고자 농어의 각 조직에서 Bradford 방법을 이용하여 가용성 단백질의 함량을 조사하였고, SDS-PAGE와 western blot analysis로 CA Ⅲ의 분자량을 조사하였으며 IEF와 western blot analysis로 CA Ⅲ의 등전점을 관찰하였다. 또한, 비교 분석을 위하여 동일한 방법으로 무지개송어, Oncorhynchus mykiss의 각 조직에서도 CA Ⅲ의 분자량과 등전점을 확인하였고 두 어류의 가용성 단백질을 ELISA법을 이용하여 CA Ⅲ의 상대농도를 비교 분석하였다. Bradford 분석에서 가용성 단백질의 함량은 상대적으로 무지개송어가 높게 나타났으며 ELISA분석에서도 CA Ⅲ의 상대농도가 무지개송어에서 높게 관찰되었다. SDS-PAGE와 western blot analysis 분석 결과 두 어류의 조직에서 분자량 30,000 (Da)의 band가 확인되었으며 IEF와 western blot analysis 분석 결과 등전점 (pI) 7.0에서 band가 확인되었다.

동물 생명체의 냉동보존 연구는 정자 및 알과 같은 단세포에서 발생배와 같은 다세포 냉동보존기법개발로 이행되어 왔다. 동물 배우자의 냉동보존에 대한 연구는 Polge and Roson (1952)의 가축배우자 냉동보존과 Shemen (1953)의 인간 배우자 냉동보존 시도가 그 효시였다. 한편, 발생배 냉동보존에 관하여는 Whittingham (1971)의 생쥐 발생배 냉동보존 연구가 최초로 이루어진 다음, 2～4세포기에서 포배에 이르기까지 발생배에 대한 냉동보존(Otoi et al., 1995; Carvalho et al., 1996; Dinnyes et al., 1996; Naitana et al., 1996; Im et al., 1997)과 쥐(Shaw et al., 1995), 소(Niemann, 1984; Im et al., 1997)의 발생배에 다양한 냉동률을 적용한 냉동보존 결과가 보고된 바 있다. 그러나 해양생물에 있어 어류나 무척추동물 발생배에 대한 냉동보존 연구는 아직 초기단계로 미미한 실정이다. 특히, 패류발생배의 냉동보존의 연구는 종 다양성이나 연구항목에 있어 부족한 부분이 많다. 더욱이, 참굴과 같은 패류의 양식에서는 발생배의 대량 냉동보존에 의해 연중 종묘생산을 꾀하거나 선발 육종한 굴의 종 보존을 하기 위해 발생배의 냉동보존 기술개발이 절대적으로 필요한 실정이다. 최근 Tiersch (2001)의 버지니아굴에 대한 유생 냉동보존을 위시하여 Choi and Chang (2003)의 진주조개, Pinctada fucata martensii 유생의 냉동보존 연구 등이 있으나, 적정 동해방지제를 찾기 위한 동해방지제 침지실험 등이 이루어지지 않아 체계적으로 연구되었다고 보기 어렵다. 따라서 조개류 발생배의 냉동보존기술을 체계적으로 개발하기 위하여는 발생배의 냉동보존 시 초기발생 단계를 포함한 발생단계별 냉동효과, 침지실험에 의한 동해방지제, 평형시간 구명 및 최종적인 냉동보존 효과 파악을 위한 동해방지제에 따른 활성영향, 적정농도 및 냉동실험이 체계적으로 이루어져야 한다. 본 연구에서는 참굴, Crassostrea gigas 발생배의 최적 냉동보존 조건을 파악하기 위하여 발생배의 동해방지제 침지농도별 활성평가 및 냉동보존 효과를 조사하였다. 2년생 양식산 참굴을 채란용 모패로 사용하였으며, 생식소절개법으로 채란․채정하여 얻은 수정란으로 실험하였다. 동해방지제별, 농도별 침지에 따른 참굴 발생배에 미치는 활성영향을 평가하기 위해, 인공해수(NaCl 2.7 g, KCl 0.07 g, NaHCO3 0.05 g, CaCl2 0.12 g, MgCl2 0.46 g, Milli-Q water 100 ㎖)를 희석액으로 하고, 여기에 dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG), propylene glycol (PG)를 최종농도가 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 M이 되도록 혼합한 다음, 발생배를 침지하였다. 10분 경과 시 발생배로부터 동해방지제를 깨끗이 제거한 다음, 5분 간격으로 20분 동안 trochophore, D형유생의 생사 여부 및 운동성을 관찰하였다. 이때 광학현미경(×100)의 한시야에서 움직이는 유생을 다음의 유생운동 평가표에 따라 유생활성지수(larval activity index, LAI)를 산정하였으며, 모든 실험은 3반복으로 실시하였다. 동해방지제별, 농도별 침지에 따른 참굴 발생배의 냉동-해동 후 생존율을 평가하기 위해, 전술한 인공해수를 이용하여 만든 0.2 M sucrose 용액을 희석액으로 사용하였으며, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG), propylene glycol (PG)을 동해방지제로 사용하여 최종농도가 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 M이 되도록 한 다음 실험하였다. 참굴의 trochophore 및 D형유생을 선택하여, 준비한 각 용액에 유생을 실온에서 10분 동안 침지한 후 0.5 ㎖ straw (FHK, Japan)에 넣고, 최초 온도가 0℃로 설정되어 있는 프로그램냉동기(삼원냉열엔지니어링, Korea)에서 냉동속도 －1℃/분으로 －12℃까지 냉각하였다. 이후 －12℃에서 식빙(seeding)한 다음, 다시 냉동속도 －1℃/분으로 또 －35℃까지 냉각하였다. －35℃에 30분 유지한 후, 유생은 즉시 －196℃의 액체질소통(MVE, USA)에 옮겨 보관하였다. 냉동보관 24시간 후 25℃의 담수에서 유생을 급속해동하여 여과해수로 희석한 다음, 광학현미경(×100)에 의해 섬모운동에 의한 유영과 심작박동 여부로 생존율을 조사하였으며, 모든 실험은 3반복으로 실시하였다. 참굴의 발생단계 중 유생의 섬모운동을 시작하는 단계인 trochophore, D형유생을 사용하여 동해 방지제별, 농도별 침지에 따른 발생배에 미치는 활성을 관찰한 결과, 각 유생의 LAI는 모든 동해방지제의 0.1 M 농도에서 높았으며, 농도가 높을수록 LAI가 낮아짐을 알 수 있었다. 동해방지제 침지농도에 따른 유생의 반응은 농도가 낮은 실험구에서 비대칭 나선운동이 멈추었으나, 농도가 높아질수록 섬모운동을 멈추고 움직이지 않는 채로 심장박동만 관찰되었다. Trochophore보다 D형유생을 사용한 실험구에서 전체적으로 LAI가 높아 D형유생을 사용한 실험구가 trochophore 실험구보다 동해방지제에 대한 내성이 강한 것으로 나타났다. 각각의 동해방지제 중에서 EG에 침지한 유생의 LAI가 다른 동해방지제보다 유의하게 높아, EG이 참굴 발생배의 냉동실험에 가장 적합하였다. 동해방지제별, 농도별 희석액 0.2 M에서 참굴 trochophore 및 D형유생의 냉동-해동후 생존율은 2.0 M EG에서 가장 높았으며, 유생의 생존율은 각각 63.0±12.3%, 88.8±4.3%였다.

In the present study, to understand the process of abnormal pigmentation (hypermelanosis) on the blind side of olive flounder P. olivaceus during early development, we investigated an time that staining on the blind side is initially observed with the naked eyes, counted the number of stained spot on the blind, and calculated the ratio of area stained on the blind side, and the ratio of fish pigmented on the blind side with growth. The present experiment was initiated at 24-day after hatching (dah), just after the starting of metamorphosis, in which fish mean size is total length (TL) 12.4±0.2 ㎜ and body weight (BW) 19.9±0.7 ㎎, and was finalized at 94-dah (TL 72.0±0.6 ㎜, BW 3,912.3±119.4 ㎎). The experimental animals were reared in FRP tank at 20±0.5℃ in water temperature and 30.9±0.1 psu. The experimental animals were feed with rotifer, Artemia nauplii and commercial food according growth stage. As results, the pigmented spots are composed with adult-type melanophores. The first spot was found in microscopy level at 38-dah (TL 18.3±0.4 ㎜, BW 57.6±4.1 ㎎), but the first staining spot observed with the naked eye was found 52-dah (TL 37.6±0.5 ㎜, BW 534.2±30.9 ㎎) around the pectoral fin and the caudal peduncle. The pigmented spots became more distinctive and expanded around the edge of rear on the blind side. The number of spots and the ratio of area stained on the blind side sharply increased between 31-dah and 80-dah, and between 66-dah and 94-dah, respectively. The ratio of fishes stained on the blind side increased between 45-dah and 73-dah, and then was stagnated to 94-dah. Therefore, these results concluded that the pigmentation on the blind side of olive flounder is not an temporary and reversible color change but an irreversible abnormal phenomenon that pigment cells is continuously differentiated on the blind side with growth for early development just after metamorphosis in artificial culture conditions.

We investigated the changes in plasma sex steroid hormones, testosterone (T), estradiol-17β (E2), 17,20 β-dihydroxy-4-pregnen-3-one (17α20βOHP), 11-ketotestosterone (11KT) and cortisol levels from ribbed gunnel, Dictyosoma burgeri in associated with annual reproductive cycle. The fish were collected at the coastal waters of Dadaepo, Busan, Korea from August 2002 to March 2003. Body weight, liver weight and gonad weight were measured for calculation of hepatosomatic index (HSI) and gonadosomatic index (GSI). Plasma steroid and cortisol levels were measured by radioimmunoassay and data were analyzed using the Kruskal-Wallis test and the Spearman rank correlation. The GSI of females increased from November, peaked in February (13.21±2.27) and decreased rapidly from March (1.05±0.23). The GSI of males also increased from November, peaked in December (0.36±0.12) and remained high to February. In females, E2 levels increased and remained high from December to February (19.81±7.46～22.85±6.18 ng/ ㎖). The levels of T showed a similar tendency and correlated (rs=0.813, p=0.0001) significantly with E2 levels. The levels of 17α20βOHP increased rapidly in February (4.78±1.01 ng/㎖) and peaked in July (5.08±0.65 ng/㎖). Cortisol level was peaked in March (2081.07±1140.02 ng/㎖) and correlated significantly with 17α20βOHP levels (rs=0.790, p=0.0001). In males, the levels of T was peaked in January (2.43±0.17 ng/㎖) and then decreased rapidly. The levels of 11KT were remained high from October to January (3.27±1.55～4.28±1.53 ng/㎖) and correlated significantly with T levels (rs=0.513, p=0.002). On the other hand, the levels of 17α20βOHP fluctuated during reproductive cycle and the variation pattern of cortisol levels were similar to females. These results suggest that plasma sex steroids in ribbed gunnels have annual periodicity, and that cortisol may involve in maturation of females.

The transcription factors, DMRT1 and FOXL2, play a role in fish sex differentiation of the bipotential precursor into the male and female pathway, respectively. In order to provide the molecular background for understanding hormonal regulation in sexual determination and differentiation in the red-spotted grouper, Epinephelus akaara, one of commercially important epinephelines, and is often used to study protogynous sex change. First, we amplified the partial sequence of two genes (DMRT1 and FOXL2) from the gonad of red-spotted grouper. Also, we surveyed the tissue-specific and sex-specific expression pattern of each genes by RT-PCR. The effects of 17α-methyltestosterone (MT) in the sexually immature gonad of red-spotted grouper were investigated by Real-time quantitative RT-PCR. Fish were treated with MT-dipping method from around 70 days after hatching (DAH) for two month. DMRT1 and FOXL2 cDNA flagments consist of 489 and 836 base pairs (bp) and encodes a protein of 162 and 278 amino acids, respectively. RT-PCR revealed that DMRT1 mRNA was expressed higher level in the testis. Foxl2 was expressed extensively in the neural and peripheral tissues with its highest level in the ovary, indicating a potential role for Foxl2 in the brain-pituitary-gonad axis. Real-time quantitative RT-PCR analyses showed that DMRT1 mRNA expression was upregulated in the MT-treated fish. These results suggest that the sex inversion of red-spotted grouper by MT might be due to the suppression of FOXL2 gene expression, and resulting in the induction of the 11-KT secretion.

Mechanisms that regulate the number of cells that constitute the body have remained largely elusive. We approached this issue in the ascidian, Halocynthia roretzi, which develops into tadpole larva with small number of cells. Embryonic cells divide 11 times on average from fertilization to hatching. The number of cell division rounds varies between tissue types. For example, notochord cells divide 9 times and give rise to large postmitotic cells in the tadpole. The number of cell division rounds in the partial embryos that were derived from tissue-precursor blastomeres isolated at the 64-cell stage also varied between tissues, and coincided with their counterparts in the intact whole embryos to some extent, suggesting tissueautonomous regulation of cell division. Manipulation of cell fates in notochord, nerve cord, muscle, and mesenchyme lineage cells by inhibition or ectopic activation of the inductive FGF signal changed the number of cell division according to the altered fate. Knockdown and missexpression of Brachyury (Bra), an FGF-induced notochord-specific key transcription factor for notochord differentiation, indicated that Bra is responsible not only for notochord differentiation but also regulates the number of cell division rounds in the notochord lineage cells, suggesting that Bra activates a putative machinery to stop cell division at the specific stage. Results of precocious expression of Bra suggested that the machinery refers the developmental clock that is likely shared in other blastomeres than notochord, and functions to terminate cell division at three rounds after the 64-cell stage. Bra does nothing about the progression of developmental clock itself.

6-hydroxydopamine (6-OHDA)은 dopamine 뉴런과 norepinephrine 뉴런을 사멸시키는 신경독소로서, 실험동물의 뇌에 직접 미세주입하여 Parkinson's disease (PD)와 유사한 증세를 야기하는 모델에 널리 사용된다. 그런데, 6-OHDA 주사후 뇌내 생식내분비 관련 유전자들의 활성을 조사한 연구는 매우 제한적이며, 더욱이 시상하부-뇌하수체-표적기관 조절 개념에서 하부 표적기관 (말초조직)에서의 활성조사는 이루어진 바가 거의 없다. 따라서 본 연구는 6-OHDA에 의한 PD 유도 흰쥐 모델을 사용하여 정소와 부신의 활성 변화를 조사하고 비교하였다. 수컷 흰쥐 (3 month)에 6-OHDA (200 ㎍ in 10 ㎕ of saline/animal)을 좌측 제3뇌실에 주입하고 2주 후 희생시켰다. 시상하부-뇌하수체-정소 호르몬 축 (생식)과 시상하부-뇌하수체-부신 호르몬 축 (스트레스)의 유전자 활성과 혈중 testosterone과 coticosterone 수준을 측정하였다. 생식관련 유전자 발현의 경우, 6-OHDA 주사에 의해 시상하부에서의 KiSS-1, GPR 54, GnRH, 뇌하수체에서의 common α, LHβ, FSHβ subunit, 정소에서의 StAR, CYP11A1, CYP17A1 mRNA 수준이 모두 유의하게 감소하였으며, 혈중 testosterone 수준도 유의하게 감소하여 생식기능의 저하를 시사하였다. 스트레스 관련 유전자 발현의 경우, 6-OHDA 주사에 의해 시상하부에서의 TH, CRH, 뇌하수체에서의 ACTH mRNA 수준은 유의하게 낮았으나, 부신 수질의 catecholamine 합성 효소들인 TH와 PNMT mRNA 수준은 오히려 유의하게 증가하였고, 부신 피질의 스테로이드 합성 관련 유전자들인 StAR, CYP11A1, 3β-HSD, CYP11B1 mRNA 수준 역시 유의하게 증가하였다. 혈중 corticosterone 수준은 증가하는 경향을 보였으나 유의성은 없었다. 이 결과는 정소와 부신 (피질)의 스테로이드 합성 기구들이 중추신경에서의 catecholamine 결핍에 상반된 반응을 나타냄을 보여준 것으로, 6-OHDA 주사 모델이 PD의 진행과 말초조직들의 기능 변화에 대한 이해를 증진시키는데 도움이 될 것으로 사료된다.

콩 등에 많이 포함된 isoflavone계 물질인 genistein (GS)은 에스트로겐 수용체에 결합하는 능력이 있어서 식물성 에스트로겐 (phytoestrogen)이라 불린다. GS는 항암효과, 심혈관계 질환 방지 효과 등이 잘 알려져 있으며, 이 때문에 현재 콩 섭취가 널리 권장되고 있다. 본 연구진은 GS 경구투여에 의해 암컷 흰쥐의 사춘기개시가 촉진됨을 보고한 바 있다. 그런데, 이러한 생식에 미치는 GS 효과가 어느 단계의 조직에서 어떻게 일어나는지에 대해서는 알려진 바가 없다. 본 연구는 GS를 경구투여 또는 뇌실내 미세주입한 모델을 사용하여 시상하부-뇌하수체에 미치는 영향과 작용기작을 조사하였다. 미성숙 (생후 30일) 그리고 성숙 (12주) 암컷 흰쥐를 사용하여 GS (3.4 ㎍/10 ㎕)을 죄측 제3뇌실에 미세주입하고 2시간 후 희생시킨 후 시상하부와 뇌하수체의 생식 관련 유전자 발현을 조사하였다. 한편, 미성숙 흰쥐 (생후 25일)에 GS를 질구개방이 일어날 때까지 경구투여하고 희생시킨 후 동일한 조사를 시행하였다. GS를 뇌실내로 투여한 미성숙 흰쥐의 시상하부에서의 KiSS-1 발현은 유의하게 증가한데 비해 GnRH 발현은 유의하게 감소하였으며, GPR54 발현은 변화가 없었다. 성숙한 흰쥐의 경우, KiSS-1, GPR54, GnRH 발현 모두 유의하게 증가하였다. GnRH 발현의 상위조절자인 GAD67발현은 미성숙, 성숙 개체 모두에서 유의하게 증가하였다. 한편, 미성숙한 개체에 GS를 경구투여했을 때, KiSS-1, GPR54, GnRH 발현 모두 유의하게 증가하였다. 미성숙한 흰쥐의 시상하부에서, GS미세주입에 의해 ERα 발현은 변화가 없었지만, ERβ 발현은 유의하게 증가하였다. GS를 미세주입한 개체의 뇌하수체에서, common α subunit 발현은 미성숙, 성숙 개체 모두 유의한 변화를 보이지 않았으며, LHβ와 FSHβ subunit mTNA 수준은 미성숙 개체에서는 유의하게 증가하였지만, 성숙한 개체에서는 반대로 유의하게 감소하였다. 본 연구결과는 GS의 사춘기개시 촉진효과가 시상하부 활성의 직접적인 조절을 통해 일어날 수 있음을 증명하였고, 사춘기 전과 성체에서의 반응, 특히 뇌하수체의 반응이 다를 수 있음을 보여주었다. 후자의 경우, 시상하부-뇌하수체 생식호르몬 조절회로의 성숙도에 따라 GS 효과가 나타나는 데 시간적인 차이가 있을 가능성을 시사한다.

Hairtail, Trichiurus lepturus, ecologically warm water fish species, belonging to family Trichiuridae, widely distributed on the coast of the West Sea, South Sea and Jeju island in the Korean Peninsula and the several sea areas in China under the natural ecosystem. The food consumption of this species has increased considerably in various types of restaurants (including restaurants specializing in serving hairtails roasted and soy-sauce glazed cutlass fish with radish or other vegetables) for a long time. However, in spite of their economic and scientific consequences, a little information currently exist regarding the physiological and ecological levels only of hairtail species in Korea. Only the biological fisheries feature, distribution and migration of hairtail, Trichiurus lepturus, in Korean waters were in vestigated (Kimatal, 1998; Parketal, 2002). Lately, imported hairtail have been changed into endemic hairtail because of high margin. In the present study, to elucidate the genetic distances and differences among geographical hairtail, Trichiurus lepturus, populations, we performed a clustering analysis of two hairtail populations collected from Korea and China. Muscle tissues were collected separately from hairtail, Trichiurus lepturus, in dividuals from Korea in the Yellow Sea and China in the East Sea, respectively. RAPD-PCR analysis was performed on DNA samples extracted from a total of 44 (specimen numbers for duplicate experiments) individuals using eight arbitrarily selected primers of two decades of different decamer primers. Hairtail muscle was collected in sterile tubes, immediately placed on dry ice, and stored at －40℃ until the genomic DNA extraction. Genomic DNA was extracted and purified under the conditions described previously (Yoon and Kim, 2004). The degree of variability was calculated by use of the Dice coefficient (F), which is given by the formula: F = 2 nab/(na+nb), where nab is the number of bands shared between the samples a and b, na is the total number of bands for sample a and nb is the total number of bands for sample b (Jeffreys and Morton, 1987; Yoke-Kqueen and Radu, 2006). Euclidean genetic distances within- and between-populations were also calculated using the hierarchical dendrogram program Systat ver.10 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). The random primers OPA-07, OPA-20, OPB-14, OPB-15, OPB-17, OPB-18, OPD-16 and URP-07 showed common, polymorphic and specific bands produced using each primer to amplify genomic DNA isolated from the muscle of individuals. Accordingly, PCR analysis generated on the RAPD data showed that the geographic hairtail population from Korea in the West Sea was more or less separated from geographic hairtail population from China in the South Sea. The hierarchical dendrogram resulted from reliable four primers, indicating three genetic clusters composed of group 1 (Korean No. 1～11) and group 2 (Chinese No. 12～22). The genetic distances between two geographic populations ranged from 0.038 to 0.476. Individual No. 09 within hairtail population from Korea was genetically closely related with No. 06 (genetic distance = 0.104). The longest genetic distance (0.476) displaying significant molecular difference was also between individual No. 01 within hairtail population from Korea and No. 22 from Chinese. In the present study, RAPD-PCR analysis has revealed significant genetic distances between two hairtail population pairs. High levels of genetic polymorphisms and the existence of population differentiation between two hairtail populations showed RAPD-PCR approach is one of the suitable tools for individuals and/or population biological DNA studies.

난자의 meiosis 중에 난자의 성숙을 결정하는 것은 많은 유전자와 단백질 발현의 time-specific한 조절 기전을 바탕으로 한다. 본 연구진은 RNAi를 이용한 선행연구 결과, Obox4 (Oocyte specific homeobox 4)는 난자 성숙과정에 있어 방추사-염색체 형성에 관여하며, Obox4가 없으면 Metaphase I (MI) 시기에 정지되는 것을 확인하였다. 흥미롭게도 Obox4 RNAi를 처리한 난자는 IBMX가 첨가되어 GV (germinal vesicle)를 유지하게 하는 배양액 내에서도 4시간째부터는 GVBD (germinal vesicle breakdown)를 시작하여 MI까지 발달하게 된다. 즉, Obox4가 cAMP-dependent GV arrest 과정에 매우 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다 (Lee et al., 2010). 따라서 본 연구는 Obox4 RNAi를 실시한 후 난자 성숙과정에 중요하다고 알려진 MAPK pathway 및 Cell cycle에 관련된 유전자의 발현 변화에 초점을 맞추어 Obox4의 기능조절에 관련된 메커니즘을 분석하고자 실시하였다. ICR 생쥐에 PMSG를 주사하고 44～48시간 후에 cumulus-enclosed oocyte complexs (COCs) 형태로 미성숙 난자를 채취한 후, 난구세포를 물리적으로 제거하여 난자만을 얻었다. Obox4 dsRNA를 미세주입하여 Obox4 RNAi를 실시한 후, 3% BSA가 첨가된 M16 배지에 0.2 mM의 IBMX를 첨가한 배지에서 배양하였다. 배양조건은 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 배양한 후에 GV 상태의 난자를 획득하였다. Dynabeads mRNA DIRECT kit (Dynal)를 이용하여 mRNA 를 추출하여 cDNA를 합성하고 MAPK signaling pathway 및 Cell cycle에 존재하는 목적 유전자들의 발현의 차이를 real-time RT-PCR을 통해 비교분석하였다. Obox4 RNAi 한 후 정상난자와 비교하여 난자의 성숙과정에 중요하다고 알려진 classical MAP kinase pathway에 관여하고 있는 유전자 및 cell cycle에 관련된 유전자의 발현을 비교한 결과, PKC (protein kinase C) 4개의 subunit 중에서 alpha를 제외한 beta, gamma, delta 3가지 subunit의 발현이 유의성 있게 감소하는 것을 확인하였다. Erk1, Erk2, Mek1, Mek2는 미세하게 증가 또는 감소하였다. Cell cycle pathway 에서는 방추사-염색체 형성에 관여하는 것으로 알려진 유전자들을 선택하여 분석한 결과 Espl1 (separin), Rad21 (cohesin) 등이 감소하였으며, 특히 APC1, PTTG (securin) 등이 유의성 있게 감소하였다. 본 연구 결과로부터 Obox4의 기능은 난자의 meiosis 과정에서 cAMP-dependent pathway 뿐만 아니라 PKC와도 깊이 관련이 있다는 것을 알 수 있었다. 앞으로 Obox4와 PKC의 기능적 연관 관계와 난자성숙과의 연관관계를 규명하는 것은 meiosis 조절기전 규명에 크게 기여할 것으로 사료된다.

Insulin like3 (INSL3, Relaxin like factor) is a critical regulator in testis translocation through Leucin rich G-protein coupled receptor 8 (Rxfp2,LGR8) during embryogenesis. In female, INSL3 and their receptor expressed in growing follicle and revealed their function in oogenesis. However, its role is not much evaluated. 6 weeks old C57BL/6 female mice used for measure the expression of INSL3 mRNA and their receptor expression by follicular stage. Follicle cell specific RNA were got from the theca cell and granulose cells which were isolated using LCM. To know the role of INSL 3 in theca cell, Rxpf2 were overexpressed during primary culture of theca cells, which were isolated from tertiary follicles after 12 hr PMSG injection and transduced the Rxfp2 using lenti virus. After 10 days of culture, the proliferation of theca cells was analyzed using EdU. Using Alzet osmotic pumps INSL3 was administered for 3 days into the ovary during superovulation induction. The INSL3 mRNA levels were significantly high in the theca cells of preovulator follicles after hCG injection. But granulose cells showed decreasing expression by growth of follicle. INSL3 stimulated the proliferation of theca cells in vitro which overexpressed the Rxpf2. By the administration of INSL3 into ovary caused the dramatical decrease the number of ovulated oocyte. Based on these results, we know that INSL3 stimulates the theca cell proliferation in as follicle stage specific manners, and estrogen is a modulator of this INSL3 mRNA expression. It suggests that the disturbance of the expression regulation of INSL3 and its receptor cause the unregulated theca cell proliferation and failing the rupture of grown follicle.

The canine major histocompatibility complex (MHC) is referred to dog leukocyte antigens (DLA), which is known to be the most polymorphic genetic system in canine species. Many cloned dogs have been produced since Snuppy, first cloned dog, there was no research about genetic identity of MHC among cloned animals. Recently in Lee’s group, two non-transgenic cloned beagles (BG1, 2) were produced by somatic cell nuclear transfer (SCNT) using fetal fibroblast (BF). Also, four transgenic cloned beagles (Ruppy 1-3, 5) were generated using transgenic BF transfected with Red fluorescent protein (RFP) gene. We hypothesize that non-transgenic (BG1, 2) and transgenic (Ruppy 1-3, 5) cloned beagles derived from identical donor cells have the same immunological genetic characteristic except for RFP gene insertion in the genome. Thus, the aim of this study is to confirm the immunological identity of DLA class II in cloned beagles produced using same nuclear donor cell. Genomic DNA was extracted from blood of BG1, BG2, Ruppy 1, 2, 3 and 5. Genomic DNA of normal two control beagle, no correlation with BF was also investigated for rulling out the possibility that beagles were inbred. Forward and reverse primers used for DLA-DQA1 and DQB1 respectively were DQAF: 5’-TAAGGTTCTTTTCTCCCTCT-3’ and DQAR: 5’-GGACAGATTCAGTGAAGAGA-3’ DQBR:5’-CTCACTGGCCCGGCTGTCTC-3’ and DQBR: 5’-CACCTCGC CGCTGCAACGTG-3’. Polymerase Chain Reaction (PCR) products were purified, sequenced directly using the Big Dye Terminator kit. Sequencing analysis was performed on an automated 3730xl DNA analyzer. In experiment 1, sequence of DLA-DQ alpha 1 (DQA1) and DLA-DQ beta 1 (DQB1) exon 2, hypervariabel region, was compared in BG1 and BG2. Experiment 2 also compared the sequence of DQA1 and DQB1 among Ruppy 1, 2, 3 and 5. Experimental 3 compared sequence of DQA1 and DQB1 among all cloned dogs (BG1, BG2 and Ruppy 1-3, 5). As a result, BG1 and BG2 have same allele for DQA1 and DQB1 as we expected. They share DQA1*00101 and DQB1*02901 in experiment 1. In experiment 2, Ruppy 1, 2, 3 and 5 also have identical DQA1*00101 and DQB1*02901 allele. No discrimination between transgenic dogs and cloned dogs was seen in DQA1 and DQB1 Allele in experiment 3. DQA1, DQB1 allele was identified as *00101 and *02901 in all dogs. We provided the allele identity of DQA1and DQB1 in cloned beagles, which can be used as preliminary data for immunological related studies. In conclusion, transgenic cloned dogs despite of red fluorescent protein genes being inserted in their nuclear DNA were immunologically compatible with non-transgenic cloned dogs. We demonstrated that cloned beagles produced using identical nuclear donor were immunologically compatible.

Photoperiod is known to be the most potent environmental stimulus for reproduction in many lower vertebrates, and it exerts an endogenous effect by causing a rhythmic change in melatonin level, which increases during the dark phase and decreases during the light phase. In recent studies, melatonin administration was capable of changing seasonal reproductive activities in several fish species, and also resulted in modulating the timing of smoltification in a salmonid fish (Amano et al., 2004; Ligo et al., 2005). In this study, we have investigated the changes of spawning activities (number of eggs, frequency of spawning) by oral administration of melatonin in the Nile tilapia, Oreochromis niloticus. Fish were obtained from a local fish farm (Chungju, Chung Buk) and acclimatized in fish rearing facilities in Sunmoon University (Asan, Chung Nam). Randomly selected 24 fishes (12 males, 12 females; 200～400 g in body weight, BW) were divided into three groups and each fish was accommodated into glass aquarium individually. Fish were fed either with control diet (0 ㎎ melatonin) or low-dose melatonin diet (0.3 ㎎ melatonin/㎏, BW) or high-dose melatonin diet (3 ㎎/㎏, BW). Fish were individually checked everyday for the presence of eggs in their mouths, and the eggs were removed and counted when found. Fish were fed twice a day, but melatonin treated diet was given only once a day at 10:00a.m.. The daily feeding ration was set at 2% of the body weight so that the fish ate all the pellets provided. Fish were sampled for blood parameters (Hb, Glu, GOT, GPT) on March 2 (Day 30), April 2 (Day 60), May 3 (Day 90), June 3 (Day 120) and July 14 (Day 160). The sampling was done between 14:00 and 16:00 p.m.. For the sampling, fish were anesthetized in 50 ppm benzocaine, and body length (BL) and BW were measured. Blood sample was collected using a heparinized syringe from the caudal blood vessel. Melatonin affects several photoperiodic signals including reproductive activities in fish. Low-dose melatonin administration appeared to disturb spawning and sexual maturation in Nile tilapia in this study. Fish treated with low-dose melatonin spawned less numbers of egg than the fish treated with high-dose. In contrast, high-dose melatonin administration caused more frequent spawning than low-dose melatonin. On the other hand, somatic growth and blood parameter were not affected by melatonin treatments. These results suggest that pertinent melatonin could be involved in providing photoperiodic information as short day photoperiod. Fish treated with over dose melatonin seemed to have no melatonin-free interval. In that circumstance the melatonin message might have not been conveyed as a proper signal.

Ethane dimethane sulfonate (EDS) 주사 흰쥐모델은 단 1회의 복강주사 (75 ㎎/㎏ BW)로 3일 이내에 성체형으로 분화된 Leydig cell들의 특이적인 사멸을 초래한다. 그 결과, 주사 후 3주까지 혈중 androgen 수준이 급감하지만, 이 기간 중 정소 안에 미리 존재하는 전구세포들로 부터의 분화와 증식이 일어나 주사 3주 후부터 androgen 분비가 재개되어 주사 6～7주 후에는 주사 전 수준으로 회복된다. 생식생리 연구에서 널리 사용되는 정소절제 후 안드로겐 보충모델 (Orchidectomy and androgen supplement model)에 비해 EDS 주사모델은 정상에 가까운 조건으로 가역적인 생식내분비 변화를 야기하므로 독특한 가치를 갖는다. 이러한 장점에도 불구하고, 이 모델을 사용한 hypothalamus-pituitary-testis (HPT) hormone axis 전반의 활성조절에 대한 연구는 매우 드문 상태이다. 따라서 본 연구는 HPT hormone axis의 활성, androgen의 주요 표적인 부정소에서의 유전자 발현 패턴과 생리적인 변화를 조사하였다. EDS 주사후 3주 이내에 시상하부 KiSS-1, GPR54, GnRH mRNA 수준이 유의하게 증가하였고, 뇌하수체 common α, LHβ, FSHβ subunit mTNA 수준이 주사 후 2～4주에서 유의하게 증가하였으며, 정소에서의 3β-HSD, StAR, LH 수용체 mRNA 수준은 주사 후 1～3주에서 유의하게 감소하였다. 부정소에서 estrogen 수용체인 ERα와 ERβ mRNA 수준은 주사 1주 후 유의하게 증가하였는데, 이후 ER α는 변화가 없었고 ERβ는 주사 후 2～3주에 유의하게 감소하였으며, androgen 수용체 mRNA는 주사 2주 후 유의하게 증가하였고, aromatase mRNA 수준은 주사 1～3주 후 유의한 감소를 보였다. 조직학적 연구를 통해 EDS 주사 후 정소와 부정소의 조직 구조에 뚜렷한 변화가 초래되었다가 점차 정상으로 회복됨을 확인하였다. 본 연구결과는 EDS 주사 후 HPT 축에서 androgen에 의한 전형적인 음성되먹임의 소실과 회복을 보여주고 있지만, 일부 유전자 발현의 경우는 되먹임 이론으로 잘 설명되지 않았다. 이 연구는 EDS 주사 흰쥐 모델이 HPT 축 상의 생식내분비 활성 변화와 안드로겐 의존성 조직들의 생리적인 변화를 조사함에 있어서 유용함을 보여준다.

대부분 이매패류의 성은 자웅이체로 알려져 있으나 굴과 (Ostreidae)를 비롯한 일부 이매패류에서 자웅동체와 성전환 현상이 보고되기도 하였다 (Eversole, 2001). 자웅이체 이매패류 가운데 Ostrea virginica (Galtsoff, 1938)와 백합과의 Mercenaria mercenaria와 Gomphina veneriformis에서는 크기가 증가할수록 개체군 내에서 암컷의 비율이 높은 경향을 보인다 (Eversole, 2001; Lee et al., 2007). 굴은 자웅이체이며, 성비 (암:수)는 1년생에서는 수컷 비율이 높으며, 2년생에서는 암컷의 비율이 높다. 또한 1년생 굴에서의 성전환이 보고되었는데, 이들은 수컷에서 암컷으로의 성전환 경향을 보인다. Coe (1943)는 생식현상의 연속성을 기준으로 이매패류에서 다음 네 가지의 자웅동체 패턴을 제시하였다. 1) functional hermaphroditism, 2) consecutive hermaphroditism, 3) rhythmical hermaphroditism, 4) alternative hermaphroditism. 본 연구는 2년생 굴, Crassostrea gigas을 대상으로 이들의 성전환 여부와 성전환 패턴을 알아보고자 하였다. 본 연구에서는 생존 상태에서 germ cell aspiration 방법으로 성을 확인한 후 개체별로 암․수를 표지하여 실험에 사용하였다. 자연조건에서 사육실험 기간은 2007년 7월부터 2008년 7월까지 약 1년이었다. 실험 개체들의 성비와 성전환은 조직학적 방법을 이용하여 확인하였다. 실험개시기 (2007년)에 평균 각고는 88.70 ㎜였으며, 실험종료기 (2008년)에 평균 각고는 99.21 ㎜였다. 실험개시기 (2007년)의 성비는 1:1.05 (F:M, n=143:150) 이었다. 하지만 실험종료기 (2008년)에 성의 구별이 불가능한 개체를 제외한 132개체의 성비는 1:2.77 (F:M, n=35:97)이었다. 성전환율은 40.15% (n=53/132)였다. 이 가운데 암컷에서 수컷으로 성이 전환된 경우는 66.07% (n=37/56)였으며, 수컷에서 암컷으로 전환된 경우는 21.05% (n=16/76)로 암컷에서 수컷으로 성전환율이 높았다. 따라서 굴의 성전환 패턴은 수-암-수로의 경향성을 보였다.

DEHP (di-ethylhexyl phthalate)는 인체노출 정도가 매우 높은 산업물질로 내분비계 장애물질이다. 임신기와 수유기를 통한 DEHP의 노출이 암컷의 사춘기 도래 및 생식내분비계에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. DEPH를 임신 (GD) 18일째부터 수유기에 해당하는 출생 후 (PND) 20일까지 모체에 0, 0.015, 0.15, 1.5, 15, 150 ㎎/㎏/day 농도로 경구투여하였다. 산자 암컷에서 PND 56일까지 발정주기 횟수를 확인하였다. 휴지기 (diestrus)와 발정기 (estrus) 시기의 mouse를 선별하여 난소 내 황체 수와 면적을 조직학적으로 분석하였으며, 과배란을 유도한 후 배란 난자 수 및 성숙도를 분석하였다. 혈중 E2농도를 측정하였으며, 휴지기와 발정기 시기의 난소에서 estrogen의 합성을 조절하는 aromatase (Cyp19a1)와 sex steroid의 합성에 필요한 콜레스테롤의 이동에 관여하는 steroidogenic acute regulatory protein (StAR) mRNA 발현을 realtime PCR로 분석하였다. 또한, DEHP에 의한 난소 내 비 정상적으로 남성화된 세포의 출현 여부를 확인하기 위해 Sertoli cell 분화조절인자로 알려진 SOX9의 발현 변화를 realtime PCR로 확인하고 면역조직화학염색을 통해 난소 내 SOX9을 발현하는 세포의 수와 면적을 분석하였다. DEHP에 노출된 F1 암컷의 발정기 도래간격이 15, 150 ㎎/㎏/day 처리군에서 길어졌으며, DEHP 0.15. 1.5, 15, 150 ㎎/㎏ 처리군에서 발정기의 횟수가 유의적으로 감소하였다. 난소 내 황체의 수가 DEHP 1.5, 15, 150 ㎎/㎏/day 실험군에서 발정기 동안 유의적으로 감소하였으며, 과배란 난자수도 DEHP 1.5, 15, 150 ㎎/㎏/day 실험군에서 감소하였으며, 형태 이상이 증가하였다. 발정기 혈중 E2 농도가 DEHP 1.5, 15, 150 ㎎/㎏/day 처리군에서 유의적으로 감소하였다. 1.5, 15, 150 ㎎/㎏/day 실험군의 발정기 난소에서 Cyp19a1, StAR 의 발현이 유의적으로 감소하였다. SOX9 mRNA 발현이 DEHP 0.15 ㎎/㎏/day 실험군에서 발현이 증가되었으며, SOX9이 발현되는 theca cell의 면적이 유의적으로 증가하였다. DEHP가 임신기 및 수유기를 통해 장기간 노출된 암컷의 성장에 영향을 미칠 가능성이 높으며, 암컷 생쥐의 사춘기 도래시기의 변형, 발정주기 불규칙화와 같은 주변적 사춘기의 변형을 유발하는 것으로 사료된다. 혈중 E2 농도 감소, 황체 수 감소 및 스테로이드형성 유전자 발현의 감소를 통해 DEHP가 난소에서의 estrogen 합성과 분비조절 기능을 교란시키는 것으로 판단되며, 난소 내 theca cell의 비정상적인 분화를 유발하여 난포의 성숙을 저해할 가능성이 있을 것으로 사료된다.