당근 (Daucus carota L.)은 β-carotene이 풍부하게 함유되어 있는 뿌리채소로서 잘 알려져 있으며 또한 신품종 육성을 위한 Agrobacterium 이용 형질전환도 비교적 용이한 식물로도 잘 알려져 있다. 본 연구에서는 뿌리 부위를 1 mm 정도의 두께로 얇게 절단한 당근채에 대하여 화학처리에 의한 표면상해를 유발시키고 이에 의한 Agrobacterium 이용 형질전환의 증대를 분석하였다. MTT를 이용한 세포활성분석을 통하여 0.1-0.3% NaOH 또는 1-4% H2O2 용액의 처리 (3 min)가 당근채 세포활성에 미약한 독성을 나타냈으나 각각 그 보다 고농도 처리에서는 육안으로 비교될 정도의 세포활성 저하를 초래하였다. NaOH나 H2O2 처리 후 1/2 x MS배지 (pH 5.7)로 세척한 당근채는 agroinfiltration 및 3 일간의 동시배양을 거쳐 β-glucuronidase (GUS) reporter gene의 발현정도를 비교하였다. 그 결과, 형광법에 의한 GUS 효소활성측정에서 화학물 처리는 10-15 배 이상의 GUS효소의 활성증대가 확인되었다.

본 연구는 vesicular stomatitis virus G glycoprotein (VSV-G)으로 피막이 형성되는 replication-defective MoMLV-based vector를 이용한 hTPO 헝질전환 닭의 생산에 관한 연구이다. 실험에 사용한 retrovirus vector의 구조는 hTPO 유전자의 발현 조절을 위해 internal promoter인 hCMV promoter를 이용하였으며 외래 유전자의 발현을 증가시키기 위해 woodchurk hepatitis virus posttranascriptional regulatory element (WPRE) 서열을 도입하였다. 재조합한 vector는 GP2 293 포장세포에 도입하여 virus를 생산하였으며 이 virus를 이용하여 감염시킨 여러 표적세포에서 hTPO의 발현과 생물학적 활성을 확인하였다. 재조합 hTPO의 생물학적 활성은 시판되고 있는 재조합 hTPO에 비해 우월한 것으로 확인되었다. hTPO 형질전환 닭의 생산을 위하여 1,000배 이상 고농도로 농축된 virus를 stage X 단계의 계란의 배반엽 층에 미세주입하여 대리난각 방법으로 배양하였다. 미세주입한 132개의 계란 중 21일 후에 11개의 계란에서 병아리가 부화하였으며 그중 4마리가 형질전환 개체로 확인되었다. 그러나 생산된 4마리 중 3마리가 부화 후 1개월 이내에 원인불명으로 사망하였다. 본 연구의 의의는 상업적 이용 가능성이 있는 생물학적 활성을 가진 사람의 cytokine 단백질의 대량 생산을 위한 생체 반응기로서의 형질전환 닭 개발의 시례를 제공하는데 있다.

laccase 유전자를 겨울우산버섯 내에서 발현을 증가시 켜 리그닌 분해효소의 활성을 강화시키고 리그닌 분해능 이 강력한 균주를 얻고자 형질전환을 시도하였다. 겨울우 산버섯 형질전환용으로 개발한 pHYgpt 벡터에 laccase 유전자를 삽입하여 과발현용 pHYlac1 벡터를 제작하여 REMI 방법으로 형질전환을 실시하였다. 항생제가 포함된 선발배지로부터 각각 13와 28개의 균사체를 선별하였고 여기서 genomic DNA를 분리하고 벡터 primer로 PCR 수행하여 pHYgpt는 9개, pHYlac1는 23개의 형질전환체 가 확인되었다. 염료 (Poly R, RBBR)가 첨가된 고체배지 에 형질전환 균사체를 배양했을 때 pHYlac1 형질전환체 는 야생형 균주에 비해 비교적 높은 탈색능을 보였다. 액 체배지 배양에서 laccase활성을 조사하기 위해 배지의 상 등액과 o-tolidine을 반응시켜 산화에 의해 나타나는 발 색의 정도를 분광기로 측정하였다. 벡터의 형질전환체는 전체 배양기간에서 야생형 균주와 활성이 비슷하게 나왔 으며 laccase가 과발현되는 pHYlac1의 형질전환체는 전 배양기간에서 높은 활성을 보였다. 배양기간과 균주에 따 라 차이는 보였지만 20일 전후에서 야생형 균주에 비해 10배에서 50배 이상 높은 활성을 보였다. 본 연구에서 형 질전환용벡터와 형질전환법을 통해 분자생물학적 기술을 이용한 분해능이 우수한 균주를 개발할 수 있는 형질전환 시스템이 안정적적으로 확립되었으며 앞으로 형질전환 체를 이용한 리그닌 분해와 이와 유사한 구조를 갖는 환경 호르몬의 분해를 위한 기술 개발에 적용할 예정이다.

농업과학기술원에서는 농업생명공학연구원, (주)마크로 젠, 건국대학교, 한경대학교, 상지대학교, 경북대학교 연 구팀과 함께 국내토종 팽이버섯에 대하여 유전체 완전염 기서열 해독 및 버섯유전체의 기능분석을 위한 연구를 바 이오그린21사업의 유전체개발이용연구단 과제로 수행하 고 있다. 팽이버섯 형질전환 연구는 이 프로젝트의 하나로 서 유전자 기능분석 기반을 구축하기 위한 과제로 국내에 서 수집된 야생팽이균주 (KACC42777)를 대상으로 Agrobacterium을 매개로 한 형질전환을 수행하여 변이 체 pool을 작성하고자 하는 목적을 가지고 있다. 팽이버섯 의 형질전환을 위하여 hygromycin 저항성 스크린의 가능 성을 확인하기 위하여 자실체 주름조직을 이용한 Agrobacterium 형질전환 체계를 확립하였다. 형질전환 용 벡터 strain은 hygromycin 저항성과 gpd promoter를 가지고 있는 AGL1 pBGgHg을 사용하였으며 항생제 농 도 30ug/ml에서 13.3%의 효율로 형질전환체 156개를 얻었다. 형질전환체는 PCR에 의하여 확인하여 유전자삽 입이 확실한 균주는 균총의 특성을 조사하였으며, 형질전 환체 자실체특성을 확인하기 위하여 병재배를 수행하였 다. AMT 방법으로 형질전환되어 얻어진 균주는 Hygromycin resistance gene이 삽입된 위치 주변의 염 기서열을 찾기 위해서 Inverse-PCR 조건을 구명하였다. 염기서열 완전해독으로 얻어지는 정보와 이들 염기서열 정보는 유전자의 기능을 대량분석하는데 유용하게 이용 될 수 있을 것이다. 본 연구에서 얻어진 모든 형질전환체 는 이후의 연구에 사용하기 위하여 특성을 DB화 하고 장 기보존되고 있다. 이 연구과제를 통하여 팽이버섯의 대량 유전자 분리 및 기능분석 기술 확립으로 유용유전자 발굴 시스템을 구축함으로써 새로운 분자육종 소재를 발굴하 여 제공하고, 팽이버섯 형질전환기술의 확립으로 Postgenome 연구 tool로 활용할 수 있을 뿐 아니라 팽이버섯 유전체 해독정보를 기반으로 한 약리작용 및 발현·대사 관련 유전자 기능분석으로 고부가성 생물소재를 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

버섯 종류에 따른 하이그로마이신 농도별 균사생장 조사 결과, 양송이·영지·상황·만가닥·맛버섯은 25 ㎍/㎖, 버들송이·잎새버섯·백계버섯은 50 ㎍/㎖, 신령버섯은 75 ㎍/㎖, 느타리버섯속은 25~75 ㎍/㎖ 농도에서 균사 생 장이 정지되었다. 버섯 종류별 자실체의 주름살에 진공처 리로 아그로박테리아를 침투하여 형질전환을 실시한 바 큰느타리, 버들송이, 신령버섯에서는 형질전환체를 얻을 수 없었다. 아그로박테리아를 이용하여 양송이 여러 품종 에 형질전환을 실시한 바 국내의 705품종은 AGL1 pBGgHg 균주에서 56%의 형질전환율을 얻을 수 있었고, 실반의 A15 품종의 형질전환율은 AGL1 pBGgHg 56%, AGL1 pGreen hph1 60%, LBA1126 pBGgHg 46% 이었 다. 양송이 A15품종의 주름살에 아그로박테리아 AGL1과 L! BA1126을 이용하여 형질전환을 할 때 AGL1이 LBA1126에 비해 형질전환율이 양호했다. 또한 아그로박 테리아를 세포내로 침투시킬 때 진공처리가 고주파에 비 해 양호하였으며, 진공처리시 형질전환율은 AGL1 pG.hph1 60%, AGL1 pBGgHg 56%로 조사되었다.