돼지 난자의 체외배양 과정에서 배양액의 삼투압의 차이 및 glycine과 alanine 단독 또는 병행 첨 가가 단위발생 및 체세포 핵이식 난자의 배 발육에 미치는 영향을 검토하였다. 난자 의 체외성숙 에는 10% 돼지 난포액, cysteine, pyruvate, epidermal growth factor, kanamycin, insulin이 첨가된 TCM-199을 이용하였다. 체외성숙 42∼44시간 후 제1극체가 방출된 난자만을 선별하여 단위발생 및 체세포 핵이식 난자를 생산한 후 modified porcine zygote medium (mPZM)-3 배양액에서 7일간 배양하였다. 실험 설계에 따라 체외배양 7일 또는 체외배양 초기 48시간 동안 280 또는 320 mOsm의 삼투압에서 난자를 배양하였다. 실험1에서 체외배양 7일 동안 280 또는 320 mOsm의 배 양액 내 glycine 또는 alanine 첨가 효과를 검토한 결과 삼투압 차이에 따른 분할률 및 배반포 발달 률에는 차이를 보이지 않았으나 320 mOsm에서 배양된 난자 및 280 mOsm에 glycine을 첨가한 군 은 280 mOsm에서 배양된 난자에 비해 높은 배반포 세포수를 보였다 (36.5-38.0 vs. 31.1, P<0.05). 실험2에서는 체외배양 초기 48시간 동안 280 또는 320 mOsm의 삼투압에서 배양하였고, 그 후 280 mOsm 배양액으로 옮겨 5일간 추가로 배양하였다. 또한 체외배양액 내 4.1 mM glycine 첨가가 배 발육에 미치는 효과를 검토하였다. 단위발생 난자를 배양초기 48시간 동안 320 mOsm에서 glycine이 첨가된 배양액에서 배양한 군이 280 mOsm에서 배양한 군에 비해 유의적으로 높은 배반 포 발달율을 보였다(36.5-50.4% vs. 25.9-27.9%, P<0.05). 또한 배양 초기 48시간 동안 320 mOsm 배 양액에 glycine을 첨가하여 배양한 난자 (50.4%)가 다른 처리군의 난자(25.9-36.5%)에 비해 유의적 으로 높은 배반포 발달율을 보였다(P<0.05). 실험3에서는 실험2와 동일한 실험설계로 체세포 핵이 식으로 작성된 배반 포의 inner cell mass (ICM)와 trophectoderm (TE) 세포수를 조사하였다. 실험결과 초기 46시간 동안 glycine이 첨가된 320 mOsm 처리군에서 배양된 난자의 ICM 비율이(26.0%) 280 mOsm 삼투압에 glycine을 첨가한 군(17.8%)에 비해 유의적(P<0.05)으로 증가하였다. 본 연구결과 단위 생식 및 체세포 핵이식 난자의 체외배양에서 glycine의 첨가 및 체외 배양초기 48시간 동안 320 mOsm 삼투압 처리는 배 발육과 배반포 세포수를 증가시키는 것으로 확인되었다.

양파는 Allium에 속하는 조미채소로 한국을 포함한 동아시아 지역에서 경제적으로 중요한 작물이다. 본 연구에서는 슈퍼생생과 뉴마르스 양파 2개 품종의 인경 부위를 이용하여 kinetin 농도 별 백색 체세포배 캘러스 형성율을 조사하였다. 양파의 백색 체세포배 캘러스를 얻기 위하여 실시된 배양 조건은 1mg/L 2.4-D를 첨가한 B5배지를 기본으로 25℃ Dark에서 배양하였다. 관찰하고자 한 kinetin의 농도는 0mg/L, 0.1mg/L, 0.3mg/L, 1mg/L, 3mg/L로 정하여 실험하였으며, MSB배지에서 배양된 2개 품종의 양파인경을 얇게 잘라 B5배지에 치상하였다. 양파의 인경 조직 중 가장 안쪽 부분부터 반응이 시작되어 백색 체세포 배 캘러스가 형성되는 것을 kinetin 농도 별로 배양한 2주 후부터 관찰할 수 있었다. 양파 2개 품종의 인경 조직을 B5배지에 배양한 8주 후에 백색 체세포 배 캘러스 형성율을 조사하였다. 그 결과 슈퍼생생과 뉴마르스의 인경 조직에서 1mg/L 2,4-D와 0.3mg/L 그리고 1mg/L kinetin이 혼용처리 된 B5배지에서 73%와 66.7%로가장 높게 나타나는 것을 알 수 있었다. 본 연구에서 확립된 슈퍼생생과 뉴마르스의 인경 조직을 이용한 백색 체세포배 캘러스 형성 조사 결과는 추후 양파의 식물체 재분화 유도 및 대량증식 연구분야에 활용이 가능할 것으로 기대된다.

본 연구는 우리나라 주요 재배종인 Muscari armeniacum ‘Early Giant’ 품종을 사용하여 엽절편체로 부터 직접적으로 신초재생과 체세포배 발생에 미치는 생장조절제의 효과를 구명하였다. 무스카리의 엽조직으 로부터 캘러스 과정을 거치지 않은 직접 신초형성은 2,4-D 0.1 mg·L−1가 함유된 배지에서 가장 좋았다. 반면, 체세포배 발생은 생장조절제를 첨가하지 않는 대조구와 IPA 0.1~1.0 mg·L−1가 함유된 농도의 배지에서 비교적 양호하였다. 무스카리의 엽조직으로부터 재생된 자구를 기외로 이식했을 때 맹아율은 모든 처리구에서 80%이상 으로 높았으며 특히 NAA 0.1mg·L−1, IPA 1.0~3.0mg·L−1 배지에서 재생된 자구의 생장이 양호하였다.

복제수정란 생산에 있어서 수핵란 내 체세포 주입 후 전기적인 융합은 필수과정인데, 이 과정을 거치는 동안 많은 수의 체세포 주입 난자가 융합에 실패하거나 lysis가 일어나게 된다. 본 실험에서는 한우 체세포를 이용하여 핵이식을 실시한 후 수핵세포질과 응합을 시도할 때 전기융합 방법에 따른 융합율과 배발달율을 검토하고자 실시하였다. 공여세포는 한우 귀 세포조직을 채취하여 0.05% trypsin과 EDTA가 첨가된 D-PBS로 세포를 분리한 후 DMEM

알파파의 재분화된 식물체로부터 다량의 이차체세포배를 유도하였으며, 이들 체세포배로부터 재분화되는 식물체의 획득빈도를 향상시키기 위하여, 캘러스에서 유래된 배의 형태 및 형태별 유식물 분화 양상에 관한 실험을 수행하였다. 2,4-D 농도에 따라 체세포배의 형성에 차이를 나타내었는데, 생장조절제가 첨가되지 않았거나, 2,4-D가 0.1 m g / ℓ 첨가된 배지에서 형성된 배는 약 57% 이상이 2개의 자엽을 갖은 정상배였으며, 2,4-D 농도가 증가할수록 정상체세포배의 출현빈도는 감소하였고, 2,4-D 4 m g / ℓ 에서는 10%만이 정상배로 나타났다. 배의 형태에 따른 발아율 및 유식물 분화양상을 조사한 결과, 2개의 자엽을 갖는 정상배의 경우는 발아율이 85%로 가장 높았으며, 정상식물체로 발육되는 비율도 80%로 나타났다. 그러나 자엽이 1개 또는 3~4개인 배는 정상적으로 발육되는 식물체의 비율이 10% 이하로 매우 낮았으며, 자엽이 5개인 배와 나팔모양의 배는 정상적인 식물체로 발달하지 못하였다.

알팔파의 하배축(hypocotyl)으로부터 캘러스 유도 및 식물체 재분화를 위하여 2.4-D 와 kinetin이 조합 처리된 MS 배지에 조직을 치상하였을 때 4주 후 캘러스가 유도되었으며, 2.4-D 4 m g / ℓ 와 kinetin 0.1 m g / ℓ 그리고 2.4-D 4 m g / ℓ 와 kinetin 0.5 m g / ℓ 조합에서 체세포배가 형성되었다. 성숙한 체세포배를 MS 기본배지로 계대배양하였을 때 정상적인 식물체로 재분화 하였다. 이차 체세포배 발생을 위하여 재분화된 기내식물의 자엽으로부 터 이차 캘러스를 유도하였다. 2.4-D의 농도에 따라 배발생 캘러스의 형성률에 차이를 보였으며, 2.4-D 4 m g / ℓ 의 MS 배지에서 배양하였을 때 배발생 캘러스의 유도가 가장 좋았다. 배발생 캘러스로부터 이차 체세포배의 발생률을 2.4-D 0.1 m g / ℓ 첨가한 MS 배지에서 가장 좋았으며, 캘러스당 배 발생률이 일차 캘러스 보다 평균 18배 증가하여, 이차 체세포배 배양에 의한 재분화 식물체의 대량증식이 가능하였다. 성숙한 이차 체세포배는 MS 기본배지에 계대배양 하였을 때 뿌리가 유도되었으며 정상적인 식물체로 발달하였다.

알팔파의 하배축 (hypocotyl)으로부터 캘러스 유도 및 식물체 재분화를 위하여 2,4-D와 kinetin이 조합 처리된 MS배지에 조직을 치상하였을 때 4주 후 캘러스가 유도되었으며, 2,4-D 4 mg/l와 kinetin 0.1 mg/l 그리고 2,4-D 4 mg/l와 kinetin 0.5mg/l 조합에서 체세포배가 형성되었다 성숙한 체세포배를 MS기본배지로 계대배양하였을때 정상적인 식물체로 재분화 하였다. 이

어수리의 미숙배로부터 체소포배 형성시 자엽의 수적변이에 미치는 cytokinin의 영향을 조사하하였다. 구상형배에 0.2mg/l의 BA, 2ip, kinetin을 각각 처리하여 2주간 배양하였을 때, 다자엽의 형성률은 각각 84.9, 42.6, 32.9%로서 대조구(25.2%)에 비하여 BA>2ip>kinein순으로 높았으며 특히 BA 처리시에 가장 높게 나타났다. 또한 BA를 농도별(0, 0.01, 0.05, 0.1mg/l)로 배발생세포괴에 2주간 처리하였을 때, 다자엽의 형성율은 각각 23.3, 39.7, 69.4, 74.4%로서 농도가 높을수록 증가하는 경향이었다. 0.2mg/l의 BA를 구상형, 심장형, 또는 어뢰형, 자엽시기의 배에 2주간 처리한 경우에 다자엽의 형성률은 각각 92.4, 84.4, 26.3%로서 배발생 초기에 처리될 경우에 더욱 높게 나타났다.

백합나무의 건전 순화묘 생산을 위해 체세포배 유래 발아체를 여러 종류의 항산화제로 전처리 후 토양이식 한 결과 500mg/L Citric acid 처리구에서 가장 높은 87.9%의 순화묘 생존율을 보였으며, 그 외 처리구에서는 대조구 (수돗물)보다 다소 높거나 낮은 현상을 보여 별 생존율 차이가 없었다. 묘고 생장의 경우 500mg/L Citric acid를 처리한 처리구에서 44.5cm를 보여 가장 높았으며, 근원경 비교의 경우에서도 마찬가지로 500mg/L Citric acid를 처리한 처리구에서 4.38mm를 보여 가장 높았다. 그러나 엽면적의 경우 수돗물 처리구 유래 순화묘가 66.03cm2으로 가장 높게 나타났으나 생중량 비교에서는 500mg/L Citric acid 유래 처리구에서 8.79g으로 가장 높게 나타났다.

멜론으로부터 체세포배를 얻기 위하여 유식물체의 배축 절편을 1 mg/L 2,4-D와 0.5 mg/L BA가 혼합첨가된 MS배지 치상하여 6주 동안 배양하였다. 배축절편으로부터 연한 노란색의 부드러운 캘러스 형성을 거쳐 형성된 체세포배중에는 2개의 자엽을 갖는 정상적인 형태의 체세포배(26%)와 합생 자엽을 갖는 나팔형의 비 정상적인 체세포배(74%)가 관찰되었다. 정상 체세포배의 하배축 부위에서는 원형의 전형성층 조직이 발달되었고, 자엽 절 부위로 이동되면서 점차 독립적으로 나뉘어져 자엽에서는 완전히 2개의 전형성층 조직으로 분화하였다. 그러나 합생 자엽을 갖는 나팔형의 체세포배에서는 하배축에서 발달된 원형의 전형층조직이 자엽 절과 자엽부위에서도 원형의 전형성층 조직으로 연결되어 있었다. 또한 2개의 자엽을 갖는 정상 및 합생 자엽을 갖는 비 정상 체세포배 tunica-corpus구조를 볼 수 없었으며 전형적인 dome구조도 관찰할 수 없었다. 이러한 결과는 체세포배에서 전형성층 조직의 분화는 자엽형성 및 유경조직 형성과 밀접한 관계가 있는 것으로 추측할 수 있다.

This study was carried out to select the appropriate medium (especially, carbon and nitrogen source, potassium phosphate and pH) for somatic embryogenesis in order to develop the rapid mass production system in suspension culture of Oplopanax elatus Nakai. Direct somatic embryos were obtained from root explants in the hormone free suspension culture (MS). Combination of NH4NO3 and KNO3 at the ratio of 1650 (mg/l) : 1900 (mg/l) obtained the better result to produce somatic embryo in suspension culture. MS medium supplemented with 170mg/l KH2PO4. The addition of 1 and 3% sucrose was effective for formation of embryogenic callus. Therefore, this report will be helped to improve the establishment for suspension culture in Oplopanax elatus Nakai.

Somatic embryos on growth regulator-free medium can be produced directly from cotyledon explants of Panax ginseng C. A. Meyer. When the embryo developmental stage was torpedo and cotyledon, the germination rate of embryos was quite high on MS medium supplemented with gibberellic acid (GA3). However, the percentage of plantlet formation at the cotyledon stage was higher than that at the torpedo stage. This result demonstrates that the embryo at the cotyledon stage was the most appropriate for increasing germination by GA3. Embryos cultured on medium including four levels of GA3 concentrations (3, 5, 10, or 20 mg/l) showed all quite high germination rates (87-91%). When the well-developed embryos were continuously cultured on media including high concentrations of GA3 from 10 to 20 mg/l, the percentage of formation of normal plantlets was lower than that seen under low concentrations from 3 to 5 mg/l. This treatment of high concentrations resulted in shoots with abnormal shape. The optimal GA3 treatment provides a basis for the efficient method obtaining healthy plantlets derived from ginseng somatic embryos.

염류내성 식물은 염류농도의 변화에 따라 세포내의 삼투압을 유지하기 위한 화합물을 합성하는 기작을 가지고 있는데 이런 화합물은 주로 proline, glycine, betaine, polyols, sugar등으로 체내에 축적함으로서 고농도의 염류에 견디는 것으로 알려져 있다. Betaine은 미생물에서 2단계 반응을 통해 choline에서 합성되는데, 첫단계는 choline dehydrogenase (CDH)에 의해서 촉매되고(Bet A gene), bet B 유전자의 산물인 betaine aldehyde dehydrogenase(BADH)에 의해 수행된다. 본 실험에서는 Bet A, Bet B 유전자를 아그로박테리움에 도입하여 새로운 conjugants 2 종을 획득하였으며 (Agrobacterium tumefaciens MP90/pBet A, Agrobacterium tumefaciens MP90/pBet B), 먼저 재조합된 binary vector가 식물에서 발현 및 형질 전환되는지 여부를 조사하기 위해서 이미 담배에 형질전환을 시켰으며, 형질전환된 담배에서는 ,고농도의 kanamycin배지에서 생장이 가능하였고, PCR에 의하여 NPT II, Bet A, Bet B gene를 조사한 결과 담배 유식물체 모두 band가 형성되어 형질전환체임을 확인할 수 있었다. 인삼에 Beth, BetB gene의 도입은 1M의 mannitol이 함유된 식물호르몬 무첨가 MS 배지에서 단일배 발생방법에 형질전환체를 획득하였으나, 형질전환체의 발생빈도(12%)가 매우 낮았다.

체세포배발생을 이용한 가시오갈피 대량증식체계 확립을 위하여 저온처리에 의한 체세포배의 장기저장 실험을 수행하였다. 현탁배양 체세포배의 4℃에서의 저온저장에는 구형배 이전의 조기단계의 체세포배가 적합하였고 2 g/l 이하의 낮은 접종밀도에서는 36개월 이상 저장이 가능하였다. 장기간 저온 저장한 체세포배는 상온에 옮긴 후 2,4-D를 첨가한 배지에서만 성장을 회복하여 배발생캘러스를 형성하였으며 배발생캘러스의 증식속도는 배양온도를 32℃로 높였을 때에 가장 효율적이였다.

약용식물로 쓰이는 선피막이 (Hydrocotyle maritima Honda)를 기내에서 재분화 가능성에 대해 조사하였다. 선피막이의 엽병 절편체를 식물생장조절제 (0~5 mg/l, NAA와 0~5 mg/l 2,4-D)가 단독 또는 0.1~2 mg/l BA와 조합 첨가된 배지 에서 6주동안 배양하였다. 2,4-D 또는 NAA을 단독으로 처리해도 캘러스가 발생하나, 가장 좋은 결과는 각각 0~5 mg/l BA, 5 mg/l NAA와 0.5 mg/l BA조합구에서 나타났다. Kinetin를 3 mg/l로 처리시 캘러스로부터 가장 많은 신초 (캘러스당 12개)을 발생시켰다. 또한, 0.5 mg/l 2,4-D와 0.5 mg/l BA가 첨가된 배지에서 유도된 배 발생 캘러스를 호르몬이 없는 배지에서 배양하였을 때, 체세포 배가 분화되었고, 식물체로 더 잘 발달하였다.

더덕 (Codonopsis lanceolata)의 자엽기의 체세포배 는 생장조절제 를 함유하지 않은 MS고체배지에 배양하였을 때 완전한 식물체로 분화되었다. 체세포배로부터 줄기 재분화에는 2% sucrose가, 뿌리의 분화에는 8% sucrose가 가장 좋았다. 줄기의 생장은 2% sucrose가, 뿌리의 생장은 4% sucrose 농도에서 가장 좋았다. 자연산 더덕뿌리, 재분화 개체의 뿌리, 배발생 캘러스, 비배발생 캘러스에서의 saponin계 물질의 함량을 HPLC로 조사한 결과 각 조직간의 물질 함량은 커다란 차이를 보였으며, 고농도의 sucrose 함유 배지에서 재분화된 뿌리의 saponin계 물질의 함량은 자연산뿌리와 비슷하였다. 세포분화가 진행됨에 따라 saponin계 물질의 함량은 급격히 감소하였다. 이러한 결과는 식물의 유용물질 생산에 효율적으로 활용될 수 있을 것이다.