형질전환 벼와 일반 벼의 환경위해성 평가 기초자료를 위해 경상남도 사천시에서 2013~2017년, 경상북도 군위군에서 2015~2016년 7월 말부터 10월 초까지 벼에 발생하는 곤충상을 조사하고 군집특성을 분석하여 비교하였다. 사천시에서 형질전환 벼는 경상대학교 LMO (Living genetically Modified Organism) 격리포장 내에서 재배되었고, 일반 벼는 경상남도 사천시 사천읍 두량리에서 재배되었다. 군위군에서 형질전환 벼는 경북대학교 LMO 격리포장 내에서 재배되었고, 일반 벼는 경상북도 군위군 효령면 화계리에서 재배되었다. 채집방법으로 육안 조사, 포충망 조사, 유아등 트랩, 끈끈이 트랩을 이용하였다. 5년 동안 사천시에서 총 15목 123과 464종 37,941개체가 채집되었고, 2년 동안 군위군에서 총 13목 111과 366종 10,030개체가 채집되었다. 다년간 LMO포장과 일반포장을 비교해본 결과 매년 상위 주요 목은 우점 순서를 제외하면 거의 같은 목이 나타나는 것을 보아 아직까지는 LMO포장과 일반포장의 차이가 뚜렷하게 나타나지 않았다고 사료된다. 그리고 LMO포장과 일반포장 사이의 유사도 지수와 일반포장 사이의 유사도 지수가 차이가 없는 것으로 보아 LMO로 인한 차이가 아닌 환경에 의한 차이로 사료된다.

곤충은 생태계 기저에 위치하며 생태계 내 여러 역할을 분담하는 생물군으로 곤충상은 지리적으로 넓은 지역에분포하며 지역에 따라 종 다양도가 높고, 환경변화에 대해서 신속히 반응한다. 형질전환작물(Living GeneticallyModified Organism; LMO)은 작물을 소비하는 생물의 문제와 더불어 농업생태계에 어떠한 영향을 미치는지가 주요관심이 되고 있다. 따라서 다년간 형질전환 작물이 재배되었던 지역과 비변형 작물 재배지역의 곤충상을 조사하는것은 각 재배지역의 환경 변화를 간접적으로 알 수 있고 환경위해성평가를 실시 할 수 있다. 작물 중 벼(Oryzasativa)는 인간에 직접적인 연관이 있기 때문에 형질전환 벼가 재배되었던 지역과 비변형 벼 재배지역의 곤충상변동 양상을 2017년 7월부터 2017년 9월까지 경상대 사천 LMO 격리포장 주변과 사천시 두량리 비변형 벼 재배지에서포충망 조사와 유아등 조사를 이용하여 비교 조사 후 군집분석을 하였다.

형질전환(Living Genetically Modified)벼와 비변형 벼 재배지역의 곤충상 변동 양상을 2016년 7월부터 2016년 10월까지 비교 조사중이다. 경상대 사천 LMO 격리포장과 경북대 군위 LMO 격리포장에서 Bt(Bacillus thuringiensis) 형질전환 벼를 재배하여 조사하였고, 사천시 두량리, 선진리, 군위군 화계리에서 비변형 벼 재배지를 선택하여 조사하였다. 현재까지 조사결과로 사천 LMO 격리포장에서는 총 10목 41과 86종 1,058개체, 군위 LMO 격리 포장은 총 11목 49과 103종 1,697개체, 두량1 포장은 총 9목 38과 80종 1,035개체, 두량2 포장은 총 11목 55과 101종 1,071개체, 선진 포장은 총 10목 43과 74종 428개체, 화계1 포장은 총 10목 44과 83종 2,663개체, 화계2 포장은 총 11목 51과 98종 1,556개체가 채집되었다. 현재 형질전환 벼와 재배 벼 사이의 차이가 나타나지 않았다. 10월까지 실험을 진행, 군집분석하여 비교할 예정이다.

형질전환(Living Genetically Modified) 벼와 비변형 재배 벼의 곤충상 변동 양상을 2015년 7월부터 2015년 10월까지 비교하였다. Hygromycin저항성 형질전환 벼는 경상대 사천 LMO 격리포장, 내건성 형질전환 벼는 경북대 군위 LMO 격리포장, 비변형 재배벼는 사천시 두량리, 사천시 선진리, 군위군 화계리에서 재배되었다. 조사기간 동안 사천 LMO 격리 포장에서는 총 14목 53과 85종 2,249개체, 군위 LMO 격리 포장에서는 총 10목 58과 95종 839개체가 채집되었고, 두량 1 포장은 총 12목 59과 102종 905개체, 두량 2 포장은 총 10목 58과 116종 959개체, 선진 포장에서는 총 10목 66과 117종 1,471개체, 화계 1 포장은 총 11목 73과 127종 1,104개체, 화계 2포장은 총 11목 62과 108종 1,533개체가 채집되었다. 총 조사된 곤충 목 별 개체수의 비율은 딱정벌레목이 25.41%로 가장 높았고, 요시마쯔깔따구(Chironomus yoshimatsui)가 선진 포장을 제외한 사천 포장에서 우점종이었으며, 애넓적물땡땡이(Enochrus simulans)는 그 외의 모든 포장에서 우점종이었다. 포충망 조사로 채집된 곤충은 144종으로 유아등 트랩으로 채집된 196종보다 낮았으나, 포장 별 구성종의 개체수 비율은 다양하였다. 본 실험결과 LMO 격리포장과 비변형 재배 벼 5개 포장 간 유사도는 차이가 없는 것으로 확인되었다.

하이그로마이신(Hygromycin) 저항성 형질전환벼와 일반 재배 동진 벼에 발생하는 곤충상을 정확히 조사하기 위한 표본추출방법을 확립하고 두 가지 벼에 발생하는 곤충상에 차이가 있는지 확인하기 위해 2014년 7월부터 10월까지 조사하고 군집특성을 분석하였다. 형질전환 벼는 경상대학교 LMO (Living genetically Modified Organism) 격리포장 내에서 재배되고 있으며, 일반 재배 동진 벼는 사천시 두량리와 사천시 선진리에서 재배되었다. 조사기간 동안 LMO 격리 포장에서는 총 10목 26과 35종 4,818개체가 채집되었고, 일반재배 벼를 재배하는 두량 1 포장은 총 9목 35과 50종 1,669개체, 두량 2 포장은 총 8목 40과 66종 1,758개체, 선진 포장에서는 총 10목 33과 45종 1,354개체가 채집되었다. 총 조사된 곤충 종 수와 목 별 개체수의 비율은 딱정벌레목이 각각 39.62%와 55.41%로 가장 높았고, 애넓적물땡땡이(Enochrus simulans (Sharp))는 모든 포장에서 우점종이었다. 포충망 조사를 이용하여 채집된 곤충은 41종으로 유아등 트랩으로 채집된 47종보다 낮았으나, 포장 별 구성종의 개체수 비율은 다양하였다. 육안조사의 경우 총 51종으로 가장 많은 종이 채집되었으며, 끈끈이 트랩을 이용한 방법으로 채집된 곤충은 14종으로 다른 3개의 채집방법에 비해서 다소 적게 채집되었다. 전체 곤충 종 군집분석 결과 모든 포장에서 종 다양도가 낮고, 특정 종이 우점하는 등 농생태계 단일 경작지의 특성을 보였다. 본 실험결과 LMO 격리포장과 동진 벼 3개 포장 간 유사도는 차이가 없는 것으로 나타났으며 육안계열인 육안조사와 포충망조사가 유인계열인 끈끈이 트랩과 유아등 조사보다 다양한 종이 채집 된 것으로 확인되었다.

하이그로마이신(hygromycin) 저항성 형질전환 동진 벼의 환경위해성 평가 기초자료를 위해 형질전환 벼와 일반 재배 동진 벼에 발생하는 곤충상을 2013년 7월부터 9월까지 조사하고 군집특성을 분석하였다. 형질전환 벼는 경상대학교 LMO(Living genetically Modified Organism) 격리포장 내에서 재배되었고, 일반 재배 동진 벼는 사천시 두량면과 진주시 대곡면에서 재배되었다. 조사기간 동안 LMO 격리포장에서는 총 7목 31과 65종 5,362개체가 채집되었고, 일반재배 벼를 재배하는 두량 1 포장은 총 5목 23과 44종 8,325개체, 두량 2 포장은 총 7목 16과 27종 4,027개체, 대곡 포장에서는 총 9목 30과 54종 4,785개체가 채집되었다. 총 조사된 곤충 종 수와 목 별 개체수의 비율은 딱정벌레목이 각각 29.3%와 88.6%로 가장 높았고, 애넓적물땡땡이(Enochrus simulans (Sharp))는 모든 포장에서 우점종이었다. 포충망을 이용한 쓸어잡기 방법으로 채집된 곤충은 29종으로 유아등 트랩으로 채집된 94종보다 낮았으나, 포장 별 구성종의 개체수 비율은 다양하였다. 전체 곤충 종 군집분석 결과 모든 포장에서 종 다양도가 낮고, 특정 종이 우점하는 등 농생태계 단일 경작지의 특성을 보였다. LMO 격리포장과 동진 벼 3개 포장간 유사도는 차이가 없는 것으로 나타났다. 본 실험결과 형질전환 벼와 비변형 벼에서 향후 환경위해성 평가를 위한 곤충상 조사는 유아등과 포충망 조사를 동시에 이용하는 것이 효과적인 것으로 확인되었다.

벼에 있어서 엽록체 small heat shock protein(small HSP)의 기능을 밝히기 위하여 Agrobacterium을 이용한 형질전환법을 이용하여 벼로부터 분리한 small HSP cDNA를 도입하였다. Agrobacterium의 감염에는 벼의 미성숙 배로부터 유도한 callus를 이용하였다. 형질전환 후의 재분화율은 약 30%였다. 형질전환을 통하여 얻어진 식물체의 genomic DNA로부터 PCR 분석과 Southern blot 분석으로 엽록체 small HSP 유전자의 도입을 확인하였다. 도입 유전자의 형질전환 벼에 있어서 유전자의 발현 양상을 northern blot 분석으로 조사하였다. 그 결과 도입된 유전자는 상온에서의 발현량이 서로 다르게 나타났으며 항상적으로 발현하고 있음을 확인하였다.

Plant molecular farming has attracted a lot of attention lately in the field of mass production of industrially valuable materials by extending application of the plant as a kind of factory concept. Among them, protein expression system using rice(Oryza sativa L.) callus is a technology capable of mass culture and industrialization because of a high expression rate of a target protein. This study was carried out to develop an Agrobacterium-mediated transformation system to increase the utilization of rice callus. The transformation efficiency was improved by using the hand when seeds were de-husked for callus induction. Furthermore, we were possible induction of callus from 6 years old seed smoothly. Selection of the callus contained the target gene was required a cultivation period of at least 3 weeks, and the most efficient selection period was after 6 weeks of culture including one passage. This selection was confirmed that the gene was stably inserted into the genomic DNA of the plant cell by the southern blot analysis and progeny test. Such an efficient selection system of rice callus that can be cultured in the long term will be contribute to the industrialization of useful recombinant proteins using rice.

Antigen production in plant is a safe and effective strategy for vaccine development. In this study, rice transformants were developed for oral vaccine against pigs diarrhea disease. DNA cassette composed with the cholera toxin subunit B (CTB) connected to the 987P-fasG, for stimulating a strong oral immune response, was introduced to rice through Agrobacterium mediated genetic transformation. Copy number analysis by TaqMan real-time PCR for transgenes revealed that transgene of 1 to 8 copies have been introduced into T1 and T2 rice seeds. The expression level of mRNA in the transformants T1 and T2 generations were up to 35 times higher than the reference value in the result of analysis by Quantitative real time-PCR. In addition, the callus cultured from rice transformants was confirmed that the introduced gene has been maintained till 9-month subculture duration. The amount of mRNA expression value was also confirmed in callus, which was maintained above 2.6 times compared with that of the standard control for a long time. These results provide that the introduced antigen for plant-based vaccine against bacterial diarrhea disease can be maintained in the callus as well as in the transgenic plant and suggest that the callus culture of plant transformant will be an effective way to obtain a plant-derived edible vaccine.

본 연구는 Bacillus thuringiensis 유래의 살충성 mCry1Ac 유전자를 무선발 형질전환 방법으로 일미 벼에 도입하여 개 발된 마커프리 형질전환 Bt 벼 2계통의 일반성분 및 주요성분 (무기질, 아미노산) 함량을 확인하여 모본벼 및 다른 일반품 종과 함량차이를 비교 분석 함으로서 형질전환 벼의 영양성 분 동등성 여부를 확인하고자 수행되었다. 영양성분 분석결과 GM 벼 현미의 일반성분 조성 중 식이섬유 함량과 일부 무기 질 함량이 모본 벼인 일미와 비교하여 다소 유의적 차이가 있 었지만 일반품종에서 나타나는 함량범위 안에 포함되는 수치 이며, 아미노산 성분과 대부분의 일반성분 및 무기질의 함량 은 전반적으로 모본과 유의적 차이가 없었다. 따라서 형질전 환 벼에서 관찰된 일부 성분 차이는 Bt 유전자의 도입 효과가 아닌 재배 환경 및 토양성분의 차이에서 기인된 것으로 형질 전환에 의한 비의도적 영양성분 변화는 없는 것으로 판단된다.

본 연구는 내충성 독소 발현 유전자(CryIIIA)를 벼에 형질 전환하여 해충에 대한 저항성을 갖도록 국내에서 개발한 해충저항성 GM벼(Btt12R)와 그 모본인 낙동벼의 주요영양성분과 항영양소를 분석하여 각 성분의 함량에 차이가 있는지를 비교하기 위해서 수행하였다. 이를 위해, 낙동벼와 Btt12R 뿐만 아니라 국내 상업화 품종인 영안벼와 화성벼를 수원 GMO 격리포장에서 동일한 조건하에 재배하여 수확한 현미를 사용하였다. 47가지 주요영양성분(8가지 일반성분, 17가지 아미노산, 8가지 지방산, 9가지 미네랄, 5가지 비타민) 중에 16가지 성분의 함량이 모본과 Btt12R 간에 차이를 보였지만, Btt12R의 이 16가지 성분은 함께 재배한 일반벼와 OECD에 명기된 함량 범위 내에 있었다. 2가지 항영양소 중 트립신 저해제는 모든 시료에 0.1 TIU/mg 미만의 극미량으로 존재했으며, Btt12R의 피트산 함량은 낙동벼와 일반벼의 피트산 범위에 포함되었다. 이상의 결과를 종합해보면, 분석한 Btt12R의 모든 주요영양성분 및 항영소의 함량이 모본 및 상업화 품종의 함량 범위에 포함되었으며, 이를 통해 CryIIIA 유전자를 벼 게놈에 삽입하는 것이 현미의 영양학적 품질에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

고세대 형질전환 벼 계통인 가뭄저항성 벼(CaMsrB2), 레스베라트롤 합성벼(RS), 인산 이용성 증진 벼(OsPT7) 3계 통과 모품종인 일미벼와 동진벼, 그리고 비교 품종으로 화성벼와 남평벼를 이용하여 수원, 익산과 밀양의 3개 지역 GMO 격리 포장에서 표준재배 시험으로 농업형질을 평가하였다. 가뭄저항성 벼 계통(CaMsrB2)은 익산에서 출수 기가 모품종 대비 1일 정도 늦었으며 라스베라트롤 합성벼(RS)는 수원, 익산, 밀양에서 모품종과 비교하여 4~5일 늦고. 인산 이용성 증진 벼(OsPT7 ) 계통은 익산지역에서 모품종 대비 1일정도 늦게 출수되었다. 형질전환 3계통의 수량성은 3개 지역에서 모품종 대비 수량지수가 88~102 였으며 수원과 익산에서 3계통은 모품종과 수량차이가 없 었으나 밀양에서 가뭄저항성 벼 계통과 인산이용성 증진 벼 계통은 모품종 보다 수량이 낮은 것으로 나타났다. 형 질전환 3계통은 모품종과 생육비교에서 출수기, 등숙비율, 천립중, 수량성과 지역 적응성에 차이가 있는 것으로 평가 되었다.

내염성과 관련 있는 벼의 CBF4 유전자(OsCBF4)를 벼에서 과발현 시켜 염 스트레스 조건에서 저항성이 증진된 내염성 유전자원을 개발하였다. RT-PCR을 수행하여 분리한 OsCBF4 유전자는 1,429 bp 크기의 뉴클레오티드로 274개의 아미노산으로 구성되었고, 벼의 다른 CBF 유전자와 33~49% 상동성을 나타내었다. 형질전환 식물체는 PCR과 Southern분석으로 OsCBF4 유전자의 벼 게놈 내 도입을 확인하였다. 전이 유전자는 벼 게놈 내에 1~4사본이 도입되었고, 선발된 형질전환 계통 모두에서 전이 유전자가 강하게 발현되었다. 염 스트레스 조건에서 형질전환 식물체는 비 형질전환 벼 보다 생육 정도가 양호하였으며, 특히 CBF4-10 계통은 염 처리 후 많은 식물체가 살아남았다. Real-time PCR 분석 결과 CBF4-10 계통은 120 mM NaCl 처리 시 전이 유전자 OsCBF4 전사체 발현이 잎에서 무처리 대비 약 3배 이상 증가하였다. 결론적으로 일반 벼에 도입된 OsCBF4 전이 유전자는 내염성 증진 기능이 있으며, OsCBF4 전이 유전자의 발현이 높은 형질전환 벼 계통은 내염성 벼 육종 소재로 이용할 수 있을 것으로 평가된다.

국내 대학과 국립식량과학원 간의 협력 연구를 통해 확보된 32개 벼 형질전환 계통들 중 작물학적 성능이 유망한 11개 계통들에 대해 작물학적 특성과 미질 특성이 평가되었다. 주요 결과는 아래와 같다.1. 이들 계통들은 수량성, 환경스트레스저항성, 내병성에관여하는 7종의 유전자가 니폰바레, 낙동벼, 동진벼등에 형질전환 되어 육성된 계통들이다.2. 미질 특성과 관련된 11개 조사형질을 이용한 다변량분석결과, 형질전환에 이용된 모품종과 도입유전자들에 대한 각 형질전환 계통군들의 뚜렷한 집구현상은관찰되지 않았다.3. 실용적 측면에서는 작물학적 특성이 모품종과 유사하면서 미질 특성이 양호한 계통이 다수 확인되었다.4. 그러나 모품종의 유용한 작물학적 특성, 즉 ‘상품성’을온전히 견지하고 있다고 판단되는 계통은 선정하기 어려웠다.5. 도입할 유전자의 선정과 유전적으로 고정된 형질전환계통을 확보하는데 소요되는 경비와 시간을 고려할때, 향후 우량 벼 형질전환 계통의 육성효율을 제고하기 위해서는 기존에 비해 보다 구체적이며 차별화 된육종전략의 개발이 필요하다고 판단되었다.

국내 대학과 국립식량과학원 간의 협력 연구를 통해 확보된 32개 벼 형질전환 계통들에 대하여 주요 작물학적 특성및 수량성을 평가하였다. 이들 계통들은 수량성, 내병성, 스트레스저항성, 미질변이 등에 관여하는 17종의 유전자가 니폰바레, 낙동벼, 동진벼 등에 형질전환 되어 육성된 계통들이다. 주요 결과는 아래와 같다.1. 형질전환 계통들은 출수기, 간장, 수장, 수수 등의 주요작물학적 특성뿐만 아니라 수량성에서도 모품종과 상당한 차이를 보였다.2. 조사된 벼 형질 전환계통들에서 조사된 농업형질에 대한다변량분석 결과, 모품종에 비해 각 형질전환 계통군 내에서 관찰된 작물학적 상이성은 일정한 방향성이 없는무작위적이었으며, 그 변화폭도 3개의 모품종들의 작물학적 차이보다 훨씬 크게 관찰되었다.3. 따라서 우량 벼 형질전환 계통 육성의 효율성을 제고하기 위해서는 모품종에 형질전환 되어 발현될 유전자의우수성뿐만 아니라, 계통육성과정에서 다양한 유전학적요인에 의해 야기되는 ‘표현형 왜곡현상’을 적절히 제어할 수 있는 육종전략도 함께 고려되어야 할 것으로 사료되었다.

본 연구는 벼에서 양성자 펌프의 활성을 증가시키는 것으로 알려진 오옥실 결합단백질 ABP57 유전자의 과발현에 따른 분자생물학적 특성을 분석해 작물 분자육종을 위한 기초자료로 활용하고자 수행하였다.ABP57 유전자 과발현 형질전환체와 대비 품종 낙동벼의 뿌리조직에서 유전자 발현 변화를 비교 분석한 결과는 다음과 같다. 두 식물체간에 발현량이 2배 이상 차이를 보인 유전자 수는 29,389개 중 총 148개였으며, 그 가운데 65개는 발현량 증가를 보였다. ABP57 유전자 과발현 형질전환체에서 발현량 변화를 보인 유전자들의 생물적 기능을 분석하기 위해 유전자 온톨로지 분석을 수행한 결과 각 부문별로 생물적 작용 부문에 67개 세부항, 세포 구성요소 부문에 59개 세부항, 분자기능 부문에 29개 세부항에 각각 영향을 미치는 것으로 나타났다. ABP57 유전자 과발현에 따라 세 개 부문 모두에서 공통적으로 나타난 영향은 H+-ATPases의 활성 증가, 여기에 필요한 에너지원 관련 화합물(ATPs, purines) 생합성 및 대사관련 활동 증가, 이온의 막투과 및 운반체 활동 증가 등이 확인되어 Kim et al.(2001)의 선행 연구결과와 일치하는 경향이었다. 그러나, 엽록체의 일부 구성요소나 G-protein 결합 단백질 신호전달경로, cytokine 신호전달 경로 등과 관련된 단백질 활성 감소는 식물 생육에 부정적 영향을 미칠 것으로 추정된다.따라서, 향후 작물의 효율적 분자육종을 위해서는 개별 유전자의 명확한 기능 분석과 더불어 유전자 상호작용에 대한 네트워크 분석 등에 대한 연구개발 노력과 함께 형질전환 식물체에 대한 생리적 특성, 표현형, 농업형질 특성 등에 대한 효과적 분석을 위해 전통육종과의 지속적 교류와 협력이 반드시 필요할 것이다.