L-asparaginase (ASNase) is a therapeutic enzyme used to treat acute lymphoblastic leukemia. Currently, the most widely used ASNases are originated from bacteria. However, owing to the adverse effects of bacterial ASNases, new resources for ASNase production should be explored. Fungal enzymes are considered efficient and compatible resources of natural products for diverse applications. In particular, fungal species belonging to the genus Trichoderma are well-known producers of several commercial enzymes including cellulase, chitinase, and xylanase. However, enzyme production by marine-derived Trichoderma spp. remains to be elucidated. While screening for extracellular ASNase-producing fungi from marine environments, we found four strains showing extracellular ASNase activity. Based on the morphological and phylogenetic analyses using sequences of translation elongation factor 1-alpha (tef1α), the Trichoderma isolates were identified as T. afroharzianum, T. asperellem, T. citrinoviride, and Trichoderma sp. 1. All four strains showed different ASNase activities depending on the carbon sources. T. asperellem MABIK FU00000795 showed the highest ASNase value with lactose as a carbon source. Based on our findings, we propose that marine-derived Trichoderma spp. are potential candidates for novel ASNase production.

Sephadex G-100 column chromatography에 의해 Trichoderma harzianum 유래 β-mannanase의 정제를 수행하여 비활성 8.44 units/mL 정제배율 56.27배를 나타내었다. SDS-PAGE에 의한 단일밴드를 확인하였고, 분자량은 52.5 kDa으로 결정되었다. 정제효소에 의해 Picea abies Galactosyl glucomannan을 가수분해하여 activated carbon column chromatography에 의해 당가수분해물을 분리 회수하여 TLC 및 Timell's method에 의해 중합도 6, 8, 9로 결정되었으며, Penicillum purpurogenum유래 정제 β-mannanase와 α-galactosidase를 이용한 enzymatic sequential action에 의해 3 가지 가수분해산물 모두 hetero type galactosyl glucomannooligosaccharides로 확인되었다. B. longum, B. bifidum, B. infantis, B. animalis, B. breve, B. adolessentis, B. auglutum의 생육활성에 대한 중합도 6, 8, 9의 영향을 검토하기 위하여 modified-MRS 배지상에 탄소원으로 중합도 6, 8, 9를 대체하여 생육활성을 비교한 결과 B. longum에서는 D.P. 6 galactosyl glucomannooligosaccharide를 탄소원으로 대체한 경우 표준 MRS배지와 비교하여 14.3배, D.P. 8에서 9.42배, D.P. 9에서 8.0배의 상대활성을 나타내어 가장 우수한 생육활성을 나타내었으며, B. breve의 경우에서도 D.P. 6에서 7.52배, D.P. 8에서 8.19배, D.P. 9에서 6.9배의 높은 활성을 보인 반면, B. bifidum에 대해서는 D.P. 6에서 2.33배, D.P. 8에서 1.33배, D.P. 9에서 2.33배의 낮은 생육활성을 나타내었다.

본 연구는 국내산 침엽수로부터 천연 항균화합물 개발을 목표로 미송 및 편백으로부터 추출물을 확보 하여 푸른곰팡이병의 원인균인 Trichoderma spp. 5종을 대상으로 항균활성을 테스트하고 GC/MS를 이 용하여 항균화합물을 탐색하였다. 미송 추출물은 Trichoderma spp.에 대해 1,000 ppm에서 저해 활성을 나타냈으며, 4,000 pp에서는 T. viride>T. harzianum>T. aggressivum 순으로 70.1, 67.3, 64.7% 의 높은 항균활성을 나타냈다. 편백 추출물도 1,000 ppm에서 항균활성을 나타냈고 4,000 ppm에서 T. viride>T. harzianum>T. aggressivum 순으로 63.2, 59.3, 59.1%의 높은 항균활성을 나타냈다. 그러나 1,000 ppm의 미송추출물과 1,000 ppm의 편백추출물을 각각 9:1, 8:2, 6:4, 2:8 (w/w) 비율의 혼합제 제로 만들어 Trichoderma spp.에 처리하였을 때 미송추출물 1,000 ppm 및 편백추출물 1,000 ppm 각 각의 단일추출물보다 낮은 항균활성을 나타냈다. Trichoderma spp. 5종에 대해 높은 항균활성을 나타 내는 미송추출물에서는 2-Isopropoxy-ethylamine 46.5%, epifluorohydrin 8.6%, trans-2,3-Dimethyloxirane 7.6%, (IR)-(-)-Myrtenal 6.0%, 2-Methoxy-4-Vinylphenol 3.9%, benzaldehyde 2.8%가 함유되어 있었고, 편백추출물에서는 α-Terpinenyl acetate 14.9%, Sabinene 10.9%, dl-Limonene 9.6%, α-Terpinolene 7.5%, α-Pinene 7.1%가 함유된 것이 확인되었다.

Recently, farmers of mushroom farms in Korea express the difficulty of shiitake cultivation due to the damage of oak log beds by unknown reason. To elucidate the cause of the damage, we investigated and isolated fungi from inside wood chip of the damaged shiitake log bed. Four of green fungi were obtained and their morphology and molecular properties examined. Trichoderma atroviride, Trichoderma citrinoviride, Hypocrea lixii (Trichoderma harzianum), and Hypocrea lutea (Gliocladiumviride) were identified. Hypocarea lutea is newly described in Korea. These species were able to produce extracellular enzymes such as cellulase, pectinase, and xylanse that might degrade wood components of oak logs. This study provides strong evidence that Trichoderma fungi are involved in the recent damages of shiitake log beds In Korea.

The Trichoderma disease, commonly referred to as green mold, has been previously considered as a problem in mushroom production, because it typically occurred in association with low-quality compost or poor hygiene. We studied growth of Trichoderma spp. (Trichoderma aggressivum, Trichoderma atroviride, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma viride) is under the control of environment factors ; 15℃ - 35 ℃ of incubation temperature, pH 3 - pH 11 of medium and 55% - 75% moisture content of rice straw medium. At the temperature of incubation, Trichoderma spp. had the highest growth rate at 25 ℃ and had no growth at 35 ℃. At the pH of medium, Trichoderma spp. had the highest growth rate at pH 5 and had the lowest growth rate at pH 11. In the Moisture content of rice straw medium, Trichoderma spp. had the highest growth at 75% moisture content and had the lowest growth rate at 55% moisture content.

푸른 곰팡이병을 일으키는 병원균은 매우 다양하며, 현 재까지 밝혀진 병원균은 Trichoderma spp., Gliocladium spp., Penicillium spp. 그리고 Aspergillus spp.로 이 중에서 Trichoderma spp.는 자낭균류에 속하는 Hypocrea spp.의 무성세대로서 발생빈도가 가장 높은 것으로 알려져 있다. 버섯의 병해 중에서 가장 방제가 어렵고 버섯의 발생 및 수확에 가장 큰 영향을 미치는 대표적인 병의 하나인 푸른 곰팡이병은 고온다습한 조건에서 많이 발생하며 발생초 기에는 버섯균과 비슷한 백색을 띄다가 포자가 형성되면 서 황록색 내지 진녹색으로 변하고, 골목의 표면에 부정형 의 병반을 형성하면서 버섯균의 생장을 억제하여 결국에 는 버섯균을 죽게 한다. 현재 버섯 재배농가에서는 버섯균 사생장 기간동안에 푸른 곰팡이병의 발생을 억제하기 위 하여 버섯배지 살균 전에 균상표면에 벤레이트, 판마쉬, 스포르곤수화제를 살포하는 것이 최대의 방제법이다. 따 라서 본 연구는 버섯 병해의 주범인 그린몰드(green mold)의 생장을 제어하기 위하여 수목추출물 및 nhexane 용해부의 효능을 비교 평가하였다. 수목추출물의 그린몰드에 대한 항균활성은 T. aggressivum 34.7%, T. atroviride 35.7%, T. harzianum 34.9%, T. koningii 31.0%, T. viride 30.7%로, 평균 33.4%의 항균 활성을 나타내었고, T. atroviride에서 수목추출물이 가장 높은 항균활성을 나타내었다. n-Hexane 용해부의 그린몰드에 대한 항균활성은 T. aggressivum 52.3%, T. atroviride 65.6%, T. harzianum 47.1%, T. koningii 48.5%, T. viride 51.1%로, 평균 52.9%의 항균활성을 나타내었고, T. atroviride에서 nhexane 용해부가 가장 높은 항균활성을 나타내었다. 수목추출물과 n-hexane 용해부의 그린몰드에 대한 항 균활성은 추출물의 농도에 따라서 5% 수준에서 유의성이 나타났다. 수목추출물과 n-hexane 용해부의 항균활성을 비교하 였을 때 수목추출물보다 수목 n-hexane 용해부에서 더 높은 항균활성이 나타났다.

표고, 느타리, 양송이, 팽이등 버섯의 종류에 관계없이 발생되고 있는 푸른곰팡이병은 그린몰드(green mold)가 그원인으로 알려져 있으며 이들의 피해는 심각하다. 푸른 곰팡이병을 일으키는 곰팡이로는 Trichoderma, Gliocladium, Aspergillus, Penicillum 등이 현재 알려져 있다. 푸른곰팡 이 병원균은 균사생장 시 균상에 발생하여 버섯균의 균사 생장을 방해하거나 기생하여 버섯균사를 사멸시키며, 버 섯수확기에 병해를 발생시키고 있다. 따라서 본 연구는 버 섯의 수확을 저하시키는 Trichoderma를 억제하기 위하 여 수목추출물 2종을 혼합한 다음 그 효능을 평가하였다. Trichoderma에 대하여 항균력을 나타내는 유효 화합 물질을 확인하기 위하여 GC/MS를 이용하여 편백 휘발성 추출물을 분석한 결과, 50개의 테르펜계 화합물이 존재한 다는 것을 확인하였고 대부분의 물질이 동정되었다. 편백 휘발성 추출물의 주요 화학적 조성은 모노테르펜류인 sabinene 11.62%, limonene 4.31%, isobornyl acetate 6.23%, α-terpinyl acetate 11.75%였으며, 세스퀴테르 펜류로 elemol 11.08%, β-eudesmol 4.02%, epibicyclosesquiphellandrene 4.18%가 나타났다. 소나무와 편백 추출물의 혼합비율 10 : 1(g/g) 제제는 T. aggressivum에서 20.4%, T. atroviride에서 14.0%, T. harzianum에서 32.0%, T. koningii에서 26.8%, T. viride에서 19.0%의 항균활성을 나타냈다. Trichoderma 균주는 편백 추출물의 첨가량이 증가함에 따라 항균활성 이 감소하는 경향을 나타냈다. Trichoderma 균주는 편백 추출물보다는 소나무 열수추출물에 대하여 영향을 받았다.

표고버섯은 Trichoderma spp.의 침입을 받으면 두 균이 접하는 부위에 다량의 laccase을 분비하여 갈색 대치선을 형성하는 것으로 알려져 있다. 하지만, 어떤 경우에는 이러한 갈변현상이 전혀 혹은 거의 나타나지 않거나 상대적으로 늦게 발현되기도 한다. 또한, 현장에서는 Trichoderma spp. 의 종류에 의해 오염이 된 톱밥배지에서 갈색 대치선이 형성되지 않은 채 표고버섯에 따라 그리고 두 길항균이 처한 사항에 따라 표고버섯의 laccase 유도정도 및 갈변현상의 형성 및 변화 정도가 다른 것으로 나타났다. 본 연구는 표고버섯과 Trichoderma spp.의 균사가 서로 접한 부위에서 발생하는 두 균의 상호작용에 대해 다양하게 조사하였다. 1. YME 배지에서 표고버섯의 laccase 활성은 주로 10일 이후에 증가되기 시작하였고 20일을 기점으로 급격히 증가하였으며 30일을 전후하여 다시 감소하기 시작했다. 또한, laccase 활성도는 균체량 상관이 있었다. 2. 본 연구에 사용된 모든 Trichoderma spp.는 표고버섯의 laccase 활성을 촉진시켰으며 균주별로 약간의 차이가 있었다. 3. YMEA 배지에서 대치배양된 표고버섯은 모든 Trichoderma spp.의 침투에 대해 brown-line을 형성함으로써 길항작용을 보이면서 두 길항균은 서로의 균사생장을 억제하였으며 표고버섯의 균사생장이 더 억제되는 것으로 나타났다. 하지만, T12균주의 경우 6일 이하로 배양된 표고버섯의 영양균사의 갈색 대치선의 형성을 유도하지 못했다. 4. Brown-line 형성 이후 Trichoderma spp.의 영양균사는 표고버섯의 영양균사 위로 계속해서 생장을 하였으며 이때, 갈색 대치선은 Trichoderma spp. 영양균사의 정단부위 직전에 형성되면서 이동하였다. 하지만, T4와 표고버섯의 영양균사가 서로 근접했을 경우 뚜렷한 갈색 대치선이 먼저 형성되고 그 이후 서로의 영역을 침범(over-growing)하지 못했으며 갈색 대치선은 이동하지 않고 안정적이었다. 5. 두 길항균이 서로 대치한 지역의 laccase 활성율을 부위별로 조사한 결과 laccase 활성율은 Trichoderma류의 종류에 상관없이 모든 처리구에서 B, C, A의 순으로 나타났다. 6. 두 길항균이 서로 대치한 지역의 pH를 조사한 결과 표고버섯의 균사 분포지역의 pH는 4.3~4.4, T12, T13의 경우 pH 4.5∼5.0, T1, T2, T5의 경우 pH 5.5∼6.7의 범위였으며 두 길항균의 길항작용 지역의 경우 두 균이 갖는 pH 범위의 중간정도의 값을 나타냈다. 이러한 결과는, T12, T13의 경우 표고버섯의 갈변 현상 유도가 느리거나 거의 유도하지 않는 점을 고려한다면, 갈변 현상 형성에 있어서 길항균의 pH 범위가 중요한 역할을 하는 것을 추정할 수 있었다. 7. 미강이 첨가된 톱밥배지 상에 3, 6, 9cm 기배양된 표고버섯에 접종된 Trichoderma spp.는 모든 처리구에서 갈색 대치선을 형성하였다. 하지만, 한천배지에서와는 상반되게 대치 후 2~3일이 지나면 표고버섯의 영양균사는 Trichoderma spp.의 균사 위로 생장을 하였다. 또한, 이때 배지의 pH는 표고버섯의 점유지역의 경우 pH 4.0∼4.5, Trichoderma spp.의 경우 pH 5.0∼6.0, 그리고 갈색 대치선을 형성지역의 경우 pH 4.5∼5.5의 범위였으나 표고버섯이 Trichoderma spp. 위로 생장한 지역의 pH는 4.3∼4.8의 범위를 나타냈다.

NaCl처리에 따른 느타리버섯균 및 푸른곰팡이균의 균사생장과 간척답 볏짚을 이용하여 느타리버섯의 재배 가능성 여부를 검토한 결과, salt 농도별 PDA배지에서의 버섯균의 균사생장은 대체적으로 0.2% 까지는 증가되며, 그 이상에서는 감소되는 경향이었다. 푸른곰팡이균은 0.5~1.0% 까지 거의 큰 차이가 없이 생장하였으며, 1.0~3.0%부터는 생장이 감소되기 시작하였고, 5.0% 에서는 현저히 감소되었다. 볏짚배지에 salt 농도별로 침수하여 버섯균의 균사생장은 한천배지와 같은 경향을 보였고, 병원균은 0.3%까지는 포자형성이 무처리구와 비슷하며, 0.5%에서는 포자형성이 감소되기 시작하여 5.0% 이상에서는 포자형성이 되지 않았다. salt 농도별로 처리된 볏짚배지에서는 처리농도가 증가함에 따라 NaO 함량은 높아졌으며, 살균전, 후 K2O는 감소되는 경향이었고, 수분함량은 NaCl 3.0% 까지는 비슷하였고 5.0%부터는 감소되었으며, pH는 뚜렷한 변화가 없었다. 볏짚배지 NaCl 농도별 처리에 따라 초발이소요일수는 차이가 없었으며, 버섯 수량은 무처리구와 비교하여 0.3% 처리구는 2,700g으로 수량이 비슷하였고 0.5% 이상에서는 수량이 감소된다. NaCl처리에 따른 침수용액 중의 EC는 볏짚 침수전보다 침수후에 높았으며, NaO 함량은 침수전, 후 모두 별다른 차이가 없었다. 볏짚종류에 따른 느타리버섯의 수량을 조사한 결과 간척답 볏짚이 일반답보다 약간 수량이 많았다.

본 시험은 우리나라에서 발생하는 푸른곰팡이병균의 종의 빈도와 발병환경 및 방제법을 구명코져 실시하였다. 시험결과 Trichoderma koningi, T. lignorum, T. glaucum과 미동정의 1종등 4종의 병원균이 분리되었고 이들의 빈도는 각각 와 이었다. 푸른곰팡이병균은 감자배양액, 왁스만배양액과 리차드배양액에서 생육이 잘 되었으며 중성-염기성배지에서는 생육이 불량한 반면 산성에서 생육이 왕성하였으며 최적산도는 pH4였다. 양송이 수확기간 중 재배사내의 온도는 내외 일 때 본명의 발생이 적었고 수량이 많으며 이상에서는 본병의 발생이 격심하였다. 푸른곰팡이병균은 복토흙 소독시 에서 60분, 혹은 에서 30분간 열처리하므로서 완전히 사멸하였고 퇴비 후발효 과정에서도 사멸되었다.