호접란에서 향기 발현에 관여하는 유전자를 분석하고 정보를 얻기 위해 향기가 있는 호접란 계통 “VIO-6” 과 향기 가 없지만 짙은 흑색에 가까운 화색을 가진 “Black Jack” 호접란 품종을 선택하여 각각 꽃의 mRNA를 분리하고 cDNA를 만든 뒤, cDNA fragment를 염기해독 하는 NGS 분석을 시도하였다. 그 중 향기성분 생합성 경로에 관여하 는 enzyme을 coding하는 유전자와 유사성이 있는 contig 및 unigene을 따로 분류하였으며 특히 난류 향기성분 발현 에 주요 성분으로 사료되는 geraniol과 linalool 합성에 관여하며 enzyme을 coding하는 유전자들의 염기서열 정보를 얻었다. 이를 이용하여 여러 식물 종에서 유사한 유전자를 찾은 결과, Linanool synthase(LIS), Farnesol kinase로 추정 되는 유전자 단편을 얻으며, 이를 호접란의 각 조직별, 시기별로 발현정도를 비교해 본 결과, LIS는 꽃이 만개한 시 기에 모든 꽃기관에서에서 고르게 발현됨을 알았고 Farnesol kinase는 꽃봉우리시기부터 만개시기까지 고르게 발 현된다는 점을 확인할 수 있었다. 이를 바탕으로 우리는 전체 유전자의 염기서열을 분석코자 PCR 또는 RACE방법 을 이용해 full length cDNA를 분리하였고 이들 향기유전자를 향기없는 호접란에 형질전환하기 위한 형질전환 벡 터를 작성하였다. 이렇게 확보된 벡터는 호접란 내 유전자의 삽입 유무를 확인하기 위해서 phosphinothricin(PPT) 저항성 유전자(BAR)와 향기유전자를 가진 발현벡터로 구축되었으며, 이 발현벡터를 호접란의 PLB조직을 이용 하여에 아그로박테리움 형질전환을 시도하였다. 아그로박테리움의 접종후 2.5mg/L PPT가 함유된 배지에서 조직 을 치상하여 형질전환체 유도를 진행하였고 그 중 PPT 저항성을 보이는 유식물체를 20개체 정도 얻을 수 있었다. 이들의 잎에서 genomic DNA를 분리 한 뒤 PCR을 통해 BAR 유전자의 발현 여부를 확인하였다.

내염성과 관련 있는 벼의 CBF4 유전자(OsCBF4)를 벼에서 과발현 시켜 염 스트레스 조건에서 저항성이 증진된 내염성 유전자원을 개발하였다. RT-PCR을 수행하여 분리한 OsCBF4 유전자는 1,429 bp 크기의 뉴클레오티드로 274개의 아미노산으로 구성되었고, 벼의 다른 CBF 유전자와 33~49% 상동성을 나타내었다. 형질전환 식물체는 PCR과 Southern분석으로 OsCBF4 유전자의 벼 게놈 내 도입을 확인하였다. 전이 유전자는 벼 게놈 내에 1~4사본이 도입되었고, 선발된 형질전환 계통 모두에서 전이 유전자가 강하게 발현되었다. 염 스트레스 조건에서 형질전환 식물체는 비 형질전환 벼 보다 생육 정도가 양호하였으며, 특히 CBF4-10 계통은 염 처리 후 많은 식물체가 살아남았다. Real-time PCR 분석 결과 CBF4-10 계통은 120 mM NaCl 처리 시 전이 유전자 OsCBF4 전사체 발현이 잎에서 무처리 대비 약 3배 이상 증가하였다. 결론적으로 일반 벼에 도입된 OsCBF4 전이 유전자는 내염성 증진 기능이 있으며, OsCBF4 전이 유전자의 발현이 높은 형질전환 벼 계통은 내염성 벼 육종 소재로 이용할 수 있을 것으로 평가된다.

국내 대학과 국립식량과학원 간의 협력 연구를 통해 확보된 32개 벼 형질전환 계통들 중 작물학적 성능이 유망한 11개 계통들에 대해 작물학적 특성과 미질 특성이 평가되었다. 주요 결과는 아래와 같다.1. 이들 계통들은 수량성, 환경스트레스저항성, 내병성에관여하는 7종의 유전자가 니폰바레, 낙동벼, 동진벼등에 형질전환 되어 육성된 계통들이다.2. 미질 특성과 관련된 11개 조사형질을 이용한 다변량분석결과, 형질전환에 이용된 모품종과 도입유전자들에 대한 각 형질전환 계통군들의 뚜렷한 집구현상은관찰되지 않았다.3. 실용적 측면에서는 작물학적 특성이 모품종과 유사하면서 미질 특성이 양호한 계통이 다수 확인되었다.4. 그러나 모품종의 유용한 작물학적 특성, 즉 ‘상품성’을온전히 견지하고 있다고 판단되는 계통은 선정하기 어려웠다.5. 도입할 유전자의 선정과 유전적으로 고정된 형질전환계통을 확보하는데 소요되는 경비와 시간을 고려할때, 향후 우량 벼 형질전환 계통의 육성효율을 제고하기 위해서는 기존에 비해 보다 구체적이며 차별화 된육종전략의 개발이 필요하다고 판단되었다.

국내 대학과 국립식량과학원 간의 협력 연구를 통해 확보된 32개 벼 형질전환 계통들에 대하여 주요 작물학적 특성및 수량성을 평가하였다. 이들 계통들은 수량성, 내병성, 스트레스저항성, 미질변이 등에 관여하는 17종의 유전자가 니폰바레, 낙동벼, 동진벼 등에 형질전환 되어 육성된 계통들이다. 주요 결과는 아래와 같다.1. 형질전환 계통들은 출수기, 간장, 수장, 수수 등의 주요작물학적 특성뿐만 아니라 수량성에서도 모품종과 상당한 차이를 보였다.2. 조사된 벼 형질 전환계통들에서 조사된 농업형질에 대한다변량분석 결과, 모품종에 비해 각 형질전환 계통군 내에서 관찰된 작물학적 상이성은 일정한 방향성이 없는무작위적이었으며, 그 변화폭도 3개의 모품종들의 작물학적 차이보다 훨씬 크게 관찰되었다.3. 따라서 우량 벼 형질전환 계통 육성의 효율성을 제고하기 위해서는 모품종에 형질전환 되어 발현될 유전자의우수성뿐만 아니라, 계통육성과정에서 다양한 유전학적요인에 의해 야기되는 ‘표현형 왜곡현상’을 적절히 제어할 수 있는 육종전략도 함께 고려되어야 할 것으로 사료되었다.

본 연구는 벼에서 양성자 펌프의 활성을 증가시키는 것으로 알려진 오옥실 결합단백질 ABP57 유전자의 과발현에 따른 분자생물학적 특성을 분석해 작물 분자육종을 위한 기초자료로 활용하고자 수행하였다.ABP57 유전자 과발현 형질전환체와 대비 품종 낙동벼의 뿌리조직에서 유전자 발현 변화를 비교 분석한 결과는 다음과 같다. 두 식물체간에 발현량이 2배 이상 차이를 보인 유전자 수는 29,389개 중 총 148개였으며, 그 가운데 65개는 발현량 증가를 보였다. ABP57 유전자 과발현 형질전환체에서 발현량 변화를 보인 유전자들의 생물적 기능을 분석하기 위해 유전자 온톨로지 분석을 수행한 결과 각 부문별로 생물적 작용 부문에 67개 세부항, 세포 구성요소 부문에 59개 세부항, 분자기능 부문에 29개 세부항에 각각 영향을 미치는 것으로 나타났다. ABP57 유전자 과발현에 따라 세 개 부문 모두에서 공통적으로 나타난 영향은 H+-ATPases의 활성 증가, 여기에 필요한 에너지원 관련 화합물(ATPs, purines) 생합성 및 대사관련 활동 증가, 이온의 막투과 및 운반체 활동 증가 등이 확인되어 Kim et al.(2001)의 선행 연구결과와 일치하는 경향이었다. 그러나, 엽록체의 일부 구성요소나 G-protein 결합 단백질 신호전달경로, cytokine 신호전달 경로 등과 관련된 단백질 활성 감소는 식물 생육에 부정적 영향을 미칠 것으로 추정된다.따라서, 향후 작물의 효율적 분자육종을 위해서는 개별 유전자의 명확한 기능 분석과 더불어 유전자 상호작용에 대한 네트워크 분석 등에 대한 연구개발 노력과 함께 형질전환 식물체에 대한 생리적 특성, 표현형, 농업형질 특성 등에 대한 효과적 분석을 위해 전통육종과의 지속적 교류와 협력이 반드시 필요할 것이다.

마늘은 양파 및 파와 더불어 백합과 작물로 오랜 재배 역사를 거치면서 돌연변이와 선발에 의해 전 세계적으로 많은 지역종으로 분화되어 오기는 하였으나 유전적 변이가 상당히 제한되어 있다. 마늘은 최근에 임성이 있는 마늘이 발견되어 육종에 이용되기는 하나 유전적 변이가 제한적인 문제점을 가지고 있다. 대부분의 마늘은 불임으로 유성생식이 불가능하여 교잡에 의한 품종육성이 어렵다. 마늘은 특히 영양번식 작물로 바이러스 감염에 의해 수량감소가 극심한 편으로 바이러스 감염에 의해 36～60%의 수량감소가 일어난다고 보고되고 있다. 이외에 마늘재배에 문제가 되는 형질을 개량하기 위해서는 육종방법의 개발이 필요하다. 이를 위한 방법으로 마늘에서 형질전환 방법의 개발이 필요하게 되었으며, 성공적인 형질전환을 위해서는 외부 유전자를 마늘의 게놈으로 도입하기 위한 세부적인 방법이 개발되어야 한다. 마늘의 형질전환은 어려운 것으로 보고되고 있는데, 우리는 마늘에서 효율적인 형질전환 방법을 개발하였으며, 형질전환 실험결과 ‘단양마늘’ 및 ‘삼척마늘’에서 제초제저항성이 도입된 형질전환 식물체를 획득하였다. 마늘 형질전환체의 확인은 PCR과 Southern blot, Northern blot 및 생물검정을 통해 마늘게놈에 안정적으로 도입된 것을 확인할 수 있었다. 기내에서 재분화되어 선발된 마늘 형질전환체가 염색체 수준에서 변화가 있는지를 확인하기 위해서 ploidy analyser를 이용하여 배수성을 조사한 결과 대부분의 마늘 형질전환체는 정상적인 염색체를 가지고 있었으나 형질전환체 중 2개의 개체가 4배체인 것을 확인할 수 있었다. 이는 조직배양 과정 중 캘러스 단계를 거치면서 염색체가 배가 된 것으로 판단되며, 형질전환체는 배수성 분석을 통해 비 정상적인 개체를 제거하는 것이 필요할 것으로 판단된다. 4배체인 형질전환 마늘은 수확기가 일반적인 형질전환체에 비해 빠르며, 수량특성은 정상적인 염색체를 가진 형질전환 마늘과 비슷한 것으로 판단된다.

벼에서 인산흡수 관련 유전자를 이용하여 무기양분이 제한된 토양에서도 작물의 생장을 극대화시키는 무기영양 이용능력이 강화된 차세대 작물을 개발하고자 인산흡수력이 강화된 OsPT(Phosphate transporter)1, 4, 7, 8-OX 계통을 세대진전시켜 T5 세대에서 유전자의 안정적 도입을 확인하였다. 형질전환 계통들의 뿌리발달 상황을 조사해 본 결과, T/R율이 모든 형질전환 계통에서 동진벼보다 높은 경향을 보였다. OsPT1-OX 및 OsPT4-OX 계통은 모본인 동진벼에 비해 전반적으로 초장, 간장 및 수장은 짧았으나 OsPT7-OX 및 OsPT8-OX 계통은 주요 농업적 특성이 비슷하였다. 인산 무시용 시 OsPT1, 7, 8-OX 계통들은 출수기가 1~2일 정도 조숙화되었으나 인산흡수량이 과다하였던 OsPT4-OX계통은 오히려 2일 정도 만숙화되어 출수기 반응이 뚜렷하였다. 인산 무시용시 관행시비 대비 쌀수량 감소율은 동진벼가 18%로 컸으나 OsPT1-OX, 7, 8계통들은 각각 10, 15, 9%에 불과하였다. 인산 무시용시 모본인 동진벼에 비해 OsPT1, 4, 7, 8-OX 계통들은 출수기의 식물체 인산흡수량이 각각 104, 128, 26, 14% 증가하였으나 질소함량은 10, 16, 12, 5% 증가에 그쳤다. 동진벼에 비하여 P/N율이 높고 간장이 짧은 OsPT1-OX과 4-OX 계통은 (2N)P시험구에서 간장이 각각 6, 4 cm 회복되었다. OsPTs-OX의 인산함량(%)을 분석한 결과, OsPT4-OX >1-OX >7-OX >8-OX 순으로 나타난 반면, OsPT1-OX이 인산흡수율이 높으면서도 생육의 변화가 적어 개체당 총 인산흡수량(g/개체)은 OsPT1-OX >4-OX >7-OX >8-OX 순으로 OsPT1-OX이 인산흡수증진 신품종으로 가장 유망하였다. OsPT1-OX계통의 부위별 인산흡수량은 줄기와 잎에서 동진벼의 2.4배, 2.2배였으나 현미와 영에서는 차이가 없었다.

배아줄기세포를 이용한 형질전환동물의 제조는 유전자의 기능 연구에 필수적이다. 특히 유전자 파괴 생쥐는 유전자의 기능 연구뿐만 아니라 사람 질병 연구에 중요한 모델이 되어 왔다. 유전자 적중법(gene targeting)과 유전자 함정법(gene trapping)은 ES 세포에서 녹아웃(knockout) 생쥐를 제조하는 대표적인 방법이다. 20여 년 전 유전자 적중법과 함정법이 최초로 개발된 이후에 이 기술은 많은 변화를 거쳤다. 특히 상동재조합에 기초한 전통적 유전자 적중법은 대량 제조기반의 조건부 유전자 적중법의 개발로 이어졌고, 유전자 적중법 및 유전자 함정법의 장점 요소의 조합은 유전자를 파괴하는 범위를 넓혔고, 유전자 적중을 더욱 효율적으로 만들었다. 이런 기술은 특정 유전자를 표적으로 하는 다양한 종류의 돌연변이 형질전환동물을 제조할 수 있게 하여 포스트게놈 시대에 요구되는 전체 유전체의 기능 연구를 더욱 효과적으로 진행시켜 줄 것이다.

콩의 PR10 유전자(GmPR10)를 벼에 형질전환하여 GmPR10 전이 유전자의 발현 정도와 내염성 관련 형질의 반응 사이의 인과관계를 조사하여 염 스트레스에 대한 GmPR10 생리적 기능을 분석하고 내염성 유전자원을 개발하였다. 1. 전이 유전자는 형질전환 계통에 따라 게놈 내에 1 ~ 6개의 사본이 도입되었고, 선발된 8개의 형질전환 계통 모두에서 전이 유전자가 발현되었으며, 발현 정도는 계통에 따라 변이를 보였다. 2. T1세대 2계통의 형질전환

사과 국내 육성 품종인 ‘홍로’의 형질전환 체계를 확립하고 칼슘이 강화된 ‘홍로’ 형질전환체를 육성하기 위하여 CAX1 유전자 전환을 실시하였다. 접종에 사용되는 절편체는 기내에서 증식 배양 중인 신초의 유엽을 사용하는 경우가 생육기 수체의 유엽을 사용하는 것보다 높은 재분화율을 보여 효과적이었다. 항생제가 첨가된 재분화 선발 배지에서 재분화된 신초들을 대상으로 PCR을 실시한 결과 5개체에서 유전자 도입을 확인할 수 있었고, 이들을 Southern b

형질전환 동물은 질병의 모델, 유전자 기능 및 조절에 관한 연구, 또는 독성물질을 탐색하는 연구 수단 등과 같은 기초 연구 분야뿐만 아니라 인체에 유용한 단백질의약품의 생산과 간, 신장 등 특정 장기의 공급원 등과 같은 임상적인 분야에서도 활용가치가 매우 크다. 이 중 형질전환 동물을 이용한 치료용 단백질의 생산은 비교적 낮은 생산 원가와, 분리와 정제의 용이성, 그리고 효율적인 대량 생산 체계의 확립 등의 장점을 가진다. 형질전환동물을 바이오의약품 생산수단으로 사용하고자 하는 발명에는 젖, 소변 또는 혈액을 통하여 백혈구증식인자, 조혈인자, 항체 등 고가의 생물의 약품을 배출시키는 소, 돼지, 흑염소 등이 등록되어 있다. 이 방법은 기존의 세포배양 방법보다 생산비용이 훨씬 저렴하고 부가가치도 높아 새로운 의약품 생산수단으로 주목받고 있다. 그러나 현재까지 방대한 시간과 비용이 투자되었음에도 불구하고 형질전환 가축을 이용한 바이오 의약품의 경제적인 성공사례는 매우 미미하며, 그 근본 원인은 대부분 포유류들의 긴 세대 간격, 천문학적인 비용과 많은 시간, 그리고 외래 단백질이 체내에서 과잉 발현됨으로 인해 발생하는 형질전환동물의 생리적인 부작용에 있다고 요약할 수 있다. 생체반응기로서 가금이 포유동물에 비해 갖는 장점은 첫째, 성성숙기간과 세대간격이 짧으며, 둘째, 포유류에 비해 번식능력이 대단히 높기 때문에(연간 300개 이상의 계란을 생산) 형질전환된 가금의 계통성립이 용이하고, 셋째, 비교적 적은 노력과 비용으로 많은 개체를 대상으로 하는 실험이 가능하다는데 있다. 또한 각 계란의 난백에는 총 3 g 정도의 단백질 성분이 있으며 단백질의 종류는 8가지 뿐이다. 따라서 형질전환 포유동물의 젖에 비하여 형질전환 닭의 계란에 함유된 재조합 단백질을 분리 및 정제하는 것이 훨씬 용이하다. 예를 들면, 현재 난백으로부터 특정 단백질을 분리하는 비용이 g당 10달러 정도로 추산되는데, 이는 세포배양액으로부터 특정 단백질을 분리하는 비용의 1%에 불과하다. 따라서 형질전환 닭의 생산은 기초적인 연구로서도 중요할 뿐만 아니라 계란을 이용한 치료용 단백질의 대량 생산에 있어서도 그 의미가 크다. 닭은 번식생리학적으로 포유동물과 매우 달라 기존의 포유동물 형질전환 방법을 동일하게 적용할 수는 없으며, 형태적, 발생학적 차이점을 고려하여 발전된 형질전환 닭의 생산방법에는 유전자를 전달받는 표적세포와 유전자전이 방법에 따라 다양한 방법이 이용되고 있다. 형질전환 닭의 생산을 위한 표적세포로는 stage X의 배반엽세포(갓 산란된 유정란의 배를 구성하는 세포), 원시생식세포(primordial germ cell), 닭의 난관에서 채집한 1세포기의 수정란 그리고 정자 등이 있다. 표적세포에 대한 유전자 전이 방법에는 물리화학적 DNA 전이 방법과 retrovirus (lentivirus) vector system을 이용한 방법으로 크게 나눌 수 있다. 각각의 방법은 외래 유전자의 전이 효율이나 다음 세대로의 전달 여부, 그리고 기술적인 용이성에서 조금씩의 차이를 나타내는데, 이 중 다음 세대로의 유전자 전달이 잘 이루어지고 기술적인 용이성이 높은 관계로 현재 가장 널리 사용되고 있는 방법은 배반엽세포 및 원시생식세포를 표적세포로 virus vector system을 이용하여 유전자를 전이하는 방법이다. 기존의 다른 유전자 전이 체계와 비교해 볼 때, 레트로바이러스를 이용한 유전자 전이는 기술적인 용이성과 효율적인 발현, 그리고 전달된 유전자의 유전적인 안정성 등의 장점을 나타낸다. 기존의 retrovirus vector에서는 주로 LTR이나 β-actin, CMV promoter 등과 같은 constitutive promoter를 이용한 외래 유전자의 발현은 개체 전체에 걸쳐 광범위하게 이루어지므로 형질전환 동물의 생리적인 부작용을 나타내는 경우가 많았다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 외래 유전자의 발현으로 인한 생리적인 부작용을 최소화하면서 또한 특정 조직에 국한하여 일어날 수 있도록 조직 특이적 발현 promoter와 유전자의 발현을 인위적으로 조절할 수 있는 promoter 등을 개발하기 위한 노력이 시급한 실정이다. 예를 들면, 닭의 난관에서 특이적으로 발현하는 ovalbumin promoter와 tetracycline inducible promoter 등이 그것이다. 또한, 필요한 경우에는 동물체에 도입된 외래 유전자의 발현을 최대화하기 위하여 WPRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)와 같은 서열도 도입되어야 할 것이다. 본 연구자들은 retrovirus vector system을 이용하여 닭의 배반엽세포에 외래유전자를 전이하는 방법으로 형질전환 닭을 생산하는 연구를 진행하고 있으며, 선행된 연구 결과에 의하면 전이된 외부 유전자가 닭의 genome 상에 삽입되어 발현되는 것을 생산된 모든 병아리에서 확인할 수 있었다. 따라서 생체반응기로서 일반 포유류가축 대신 닭을 사용하는 것이 앞에서 언급한 시간적, 경제적 장점 외에 형질전환개체의 생산 측면에서의 성공 가능성이 훨씬 높다고 단언할 수 있다. 본 연구자는 외래 유전자의 발현율을 증가시키기 위하여 retrovirus vector에 WPRE 서열을 도입하였으며, 외래 유전자의 과잉 발현에 의한 개체의 생리적인 부작용을 최소화하기 위하여 외래 유전자의 발현에 대한 개시 및 종료가 조절 가능한 tetracycline inducible expression system을 도입하여 형질전환 닭을 생산하였다. 현재까지 형질전환 닭으로부터 발현을 시도한 재조합 단백질로는 단일클론항체, FSH, EPO, G-CSF 그리고 interferon 등이 있으며, 이들 단백질이 산란된 계란의 흰자에 분비되도록 하는 기술을 개발하여 실용화하려는 시도를 하고 있다. 그러나 현재까지 개발된 형질전환 닭의 생산에 있어서 매우 만족할 만한 성공적인 사례는 거의 전무한 실정이며, 이에 생체반응기로서의 형질전환 닭의 생산에 관한 연구가 적극적으로 진행되어야 할 것으로 생각된다.