본 연구에서 multiplex PCR과 real-time PCR을 이용하여 창난젓의 원료를 감별할 수 있는 새로운 판별법을 개발하였다. 명태와 가이양의 종 특이 프라이머를 디자인하고, 명태와 가이양의 genomic DNA를 template로 single PCR과 multiplex PCR을 실시하였다. PCR을 실시한 결과, single PCR에서 명태(297 bp)와 가이양(132 bp)에 해당하는 PCR 밴드를 확인하였으며 교차 반응이 일어나지 않는 것을 확인하였다. Multiplex PCR에서 명태와 가이양 사이에 교차 반응없이 증폭이 일어나는 것을 확인하였다. Real-time PCR 결과, 명태 종 판별 프라이머에서 명태의 Ct 평균값은 20.765±0.691, 가이양 시료에서 Ct 평균값은 35.719±1.828이 었으며, 가이양 종 판별 프라이머에서 명태 시료의 Ct 평균 값은 35.996±1.423, 가이양 시료의 Ct 평균값은 20.096±0.793 으로 프라이머의 효율성, 특이성 및 교차 반응성에서 유의한 차이가 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로 시중에서 판매되는 7개 제품을 multiplex PCR 및 real-time PCR로 확인 하였으며, 모든 시료에서 유효한 결과를 확인하였다. 본 연구에서 제작된 명태와 가이양에 대한 종 특이적 프라이머는 가공된 젓갈 시료의 원료의 판별 가능하며, 이러한 결과는 식품안전관리에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Staphylococcus aureus와 Bacillus cereus는 식중독을 일으키는 주요한 원인균 중 하나로 각종 식품에서 검출되면서 많은 주의가 요구되고 있다. 식중독 발생의 원인균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 여러 가지 방법 중 DNA 분석을 기반으로 하는 PCR 검출법이 보편적으로 사용되고 있다. 본 연구에서는 샌드위치와 같은 즉석 섭취 식품에서 식중독을 유발할 수 있는 S. aureus와 B. cereus 의 신속검출을 위해 conventional PCR과 real-time PCR의 특이도 및 민감도를 비교하였다. 그 결과, 검출한계 범위가 배양액에서는 cPCR의 경우 S. aureus (104-106 CFU/mL), B. cereus (103-105 CFU/mL) 이였고, real-time PCR의 경우 S. aureus (103-106 CFU/mL), B. cereus (102-105 CFU/mL) 이였다. 식품에서는 cPCR의 경우 S. aureus (104-106 CFU/mL), B. cereus (103-105 CFU/mL) 이고, real-time PCR의 경우 S. aureus (104-106 CFU/mL), B. cereus (103-105 CFU/mL) 으로 나타났다. Real-time PCR법이 cPCR법 보다 10배 이상 더 민감한 것으로 나타났다. 따라서 real-time PCR은 우수한 민감도를 지닌 검출기법으로 식중독 세균 검출에 있어 매우 효과적인 방법으로 사료된다.

The detection of Mycobacterium bovis (M. bovis) in environmental samples with precision is imperative to control bovine tuberculosis (bTB) infections at the herd level, as residual M. bovis remains one of the major causes of recurring infections. In this study, a nested PCR method for the detection of M. bovis in environmental samples was applied to identify potential environmental reservoirs of the bacterium. A set of 200 environmental samples (167 fecal samples and 33 water samples) from 39 herds with a history of bTB outbreak was analyzed using a nested PCR method to detect residual M. bovis. Amplicon libraries of the IS6110 target gene fragment were amplified from M. bovis DNA using two established primer sets. A positive nested PCR result was observed in 69.5% of fecal samples and 66.7% of water samples, thus showing that residual M. bovis was present in the environmental samples of bTB-positive herds in a high proportion. This study is the first to demonstrate high levels of M. bovis DNA in environmental samples and to show that environmental reservoirs of this pathogen contribute to recurring outbreaks of bTB. Environmental monitoring of herds in which bTB outbreaks have occurred with high sensitivity and specificity is expected to help prevent the recurrence of potential bTB disease and improve the herd environment.

본 연구에서는 PCR법을 이용하여 농산물 중 enterotoxin 생성 Clostridium perfringens를 신속 분석할 수 있도록 전처리법을 확립하고자 수행하였다. 이를 위하여 C. perfringens 포자를 상추, 토마토, 고추, 들깻잎에 102, 103, 104, 105, 106, 107 spore/g 농도로 포자를 접종하였다. 포자가 접종된 농산물들은 pulsifier, stomacher, sonicator로 처리하고 boiling법 혹은 상용화 된 kit로 DNA를 추출한 후 PCR법을 수행하고 검출한계를 비교하였다. 그 결과, 3가지 전처리법에 있어서는 pulsifier가, DNA 추출에 있어서는 상용화된 DNA 추출 kit를 활용하는 것이 농산물 중 C. perfringens의 검출한계를 10-100배 낮출 수 있었다. 특히 들깻잎, 방울토마토처럼 전처리 방법에 따른 탁도의 변화가 큰 농산물은 전처리법과 DNA 추출법이 PCR 반응에 미치는 영향이 큰 것으로 나타났다. 따라서 본 연구 결과를 통해 볼 때 PCR법을 이용한 농산물 중 C. perfringens 를 검출하는데 있어 검출감도를 높이기 위해서는 pulsifier 를 이용하여 전처리하고 상용화된 DNA 추출 kit를 사용하는 것이 적절한 것으로 판단된다.

참돔은 등쪽에 푸른 반점이 흩어져 있고, 홍민어는 꼬리 쪽에 검은 점이 있어 원물 형태는 쉽게 구분할 수 있다. 그러나 횟감이나 필렛으로 이용 시 참돔과 홍민어를 구분하기 어려워, 참돔의 종 특이 primer를 개발 및 검증하고 모니터링을 통해 참돔의 위변조 사례를 조사하고자 하였다. 시료에서 gDNA를 추출하여 PCR을 진행하였으며 참돔 primer의 product size는 468 bp, 홍민어 primer의 product size는 181 bp으로 설계하였다. Multiplex PCR 결과 참돔과 홍민어에 대한 종 특이적 증폭이 확인되었다. 또한, 참돔과 홍민어 PCR 민감도 실험 결과 참돔 primer는 1 ng, 홍민어 primer는 0.1 ng 까지 밴드가 확인되었다. 모니터링 결과 참돔으로 구매한 시료 19건 모두 참돔으로 판정되었다. 따라서 본 연구에서 제작된 참돔과 홍민어 종에 대한 종 특이적 primer는 횟감 등 수산물에도 적용할 수 있어 현재 유통 및 판매되고 있는 참돔 및 홍민어 판 별에 적합성을 확인하였다.

Direct injection of genome editing tools such as CRISPR/Cas9 system into developing embryos has been widely used to generate genetically engineered pigs. The approach allows us to produce pigs carrying targeted modifications at high efficiency without having to apply somatic cell nuclear transfer. However, the targeted modifications during embryogenesis often result in mosaicism, which causes issues in phenotyping founder animals and establishing a group of pigs carrying intended modifications. This study was aimed to establish a genomic PCR and sequencing system of a single blastomere in the four-cell embryos to detect potential mosaicism. We performed genomic PCR in four individual blastomeres from four-cell embryos. We successfully amplified target genomic region from single blastomeres of 4-cell stage embryo by PCR. Sanger sequencing of the PCR amplicons obtained from the blastomeres suggested that PCR-based genotyping of single blastomere was a feasible method to determine mutation type generated by genome editing technology such as CRISPR/Cas9 in early stage embryos. In conclusion, we successfully genotyped single blastomeres in a single 4-cell stage embryo to detect potential mosaicism in porcine embryos. Our approach offers a simple platform that can be used to screen the prevalence of mosaicism from designed CRISPR/Cas9 systems.

적조가 처음 시작되는 해역을 조기에 파악하기 위하여 Quantitative real-time PCR (qPCR)을 경남해역 적조현장에 활용하였다. 2019년 경남해역을 대상으로 Cochlodinium polykrikoides를 qPCR로 정량분석한 결과, 6월 초에 저밀도로(0.0015~0.0058 cells mL-1) 검출되기 시작하여 8월 중순에는 최대 0.163 cells mL-1 밀도로 증가하였고, 주로 남해도 주변에서 높게 검출되었다. 8월 말에는 현미경 검경으로 남해도 주변에서 높게 출현함이 확인되었고(최대 24 cells mL-1), 9월 2일에는 남해도에서 적조주의보가 발령되었고(최대 200 cells mL-1), 9월 11일에는 최대 12,000 cells mL-1까지 남해도 해역에서 발생하였다. 위 결과는 극미량의 C. polykrikoides이 적조발생 전에 남해도에서 검출 되었고 이후 같은 해역에서 적조가 발생되었음을 보여준다. 이는 qPCR이 극미량의 C. polykrikoides을 조기검출하는데 유용한 방법임을 보여준다.

Widespread consumption of fresh-cut vegetables without cooking results in ingestion of major foodborne pathogens including Bacillus cereus. In this study, we aimed to develop a method to rapidly detect B. cereus in fresh-cut vegetables by combining commercial PCR analysis with enrichment of the pathogenic levels. A mixture of B. cereus strains (KCTC1013, KCTC1014, KCTC1092, KCTC1094, and KCTC3624) was inoculated on the surface of fresh-cut cabbage lettuce (20 g) and baby leafy vegetables (10 g) to concentration 1, 2, 3, 4, and 5 log CFU/g. Eighty milliliters of TSB with 0.15% polymyxin B was used for cabbage lettuce, and 90 mL of medium was used for baby leafy vegetables and incubated at 42oC for 0, 2, 3, 4, 5, 6, and 7 h. One milliliter of the enriched media was plated on mannitol-egg yolk-polymyxin agar for quantification, and another 1 mL was used for DNA extraction for PCR analysis. Additionally, the minimum number of sub-samples to be tested from a pack of fresh-cut vegetable samples was determined using 5 sub-samples. The results from this study showed that for detecting B. cereus in fresh-cut cabbage lettuce, 3, 4, 5, 6, and 7 h enrichment were required to at least detect 5, 4, 3, 2, and 1 log CFU/g of B. cereus, respectively. B. cereus in fresh-cut baby leafy vegetables could be detected after 2, 3, 4, 5, and 6 h of enrichment at 5, 4, 3, 2, and 1 log CFU/g, respectively, using a combination of enrichment and PCR analysis. To determine if a pack of fresh-cut vegetable is positive, the minimum number of sub-samples should be 3. These results can be used to develop a rapid detection method to semi-quantify B. cereus in fresh-cut vegetable samples combining enrichment and PCR.

Emulsion polymerase chain reaction (PCR) is performed on compartmentalized DNA, allowing a large number of PCR reactions to be carried out in parallel. Emulsion PCR has unique advantages in DNA amplification. It can be applied in many molecular biological assays, especially those requiring highly sensitive and specific DNA amplification. This review discusses the principle of emulsion PCR and its applications in biotechnology. Related technologies are also discussed.

This study constructed a wheat-specific primer and a probe using the internal transcribed spacer (ITS). 2 regions of wheat (Triticum aestivum) and real-time PCR conditions were established. The calibration curve showed a slope of -3.356, a correlation coefficient of 0.998, and an amplification efficiency of 98.589%. Experiments were carried out on the rice flour mixed with 50%, 10%, 1%, 0.1%, 0.01%, and 0.001% of wheat. The result showed that it was possible to detect samples mixed with up to 0.01% of wheat. As a result of checking, the wheat detection potential of rice, 34 processed foods, and seven processed foods was ascertained. The real-time PCR method using the wheatspecific primer and probe developed in this study can be used to identify the authenticity of the raw materials, such as the incorrect indication of the raw materials utilized and the unintended mixing of wheat during the manufacturing process.

최근 한국에서 발생한 Salmonella로 인한 식중독 사고 는 2018년 9월 학교급식에서 제공된 초콜릿 무스 케이크가 원인이 되었다. 이 연구의 목적은 Salmonella Typhimurium이 인위적으로 접종된 무스케이크와 티라미수에서 3M Molecular Detection Assay 2 –Salmonella와 식품공전에 등재된 방법인 분리배지와 real-time PCR을 비교하는 것이었다. 무스케이크 2종과 티라미수 2종 25 g에 225 mL BPW를 넣고 37oC에서 24시간 동안 증균 배양하 였다. 배양 후, 3M Molecular Detection Assay 2 – Salmonella, 분리배지 그리고 real-time PCR로 분석하였다. 초콜릿 무스 케이크를 제외하고 3가지 방법은 유사한 결 과를 보였다. 초콜릿 무스 케이크에서 분리배지와 3M Molecular Detection Assay 2 –Salmonella는 모든 접종수 준에서 동일한 결과를 나타낸 반면 real-time PCR은 104 CFU/25g수준에서 1번의 양성결과를 제외하고 모두 검출 되지 않았다. 초콜릿 무스에 S. Typhimurium을 102 CFU/ 25 g 수준으로 접종하였을때, real-time PCR를 이용한 검출은 15%에서는 부분적인 음성을 나타냈고, 20-100% 함량의 초콜릿 무스에서는 모두 음성이었다. Real-time PCR 로는 chocolate이 15% 이상 함유된 식품에서의 Salmonella 균 검출이 불가능하였지만, LMAP 기반의 3M Molecular Detection Assay 2으로는 chocolate 농도에 관계없이 검출이 가능하였다.

본 연구에서는 한국 전통 식품에서 Salmonella Typhimurium 와 Listeria monocytogenes의 검출에 대하여 LAMP에 기 반한 3M Molecular Detection Assay 2 (3M MDA 2)와 식품공전에 등재된 분리배지, real-time PCR의 검출 성능을 비교하고자 하였다. 육회와 육사시미에 100–104 CFU/25 g 의 수준으로 S. Typhimurium와 L. monocytogenes을 각각 접종하였다. Citrobacter freundii와 Listeria innocua는 S. Typhimurium와 L. monocytogene의 검출에 영향을 주는 균으로 사용하였다. S. Typhimurium와 L. monocytogenes만 100–104 CFU/25 g수준으로 접종한 모든 시료에서는 분리 배지, real-time PCR과 LAMP에서 양성으로 검출되었다. C. freundii와 L. innocua를 같이 접종한 경우에서 부분적으로 양성이 나타났다. 육회와 육사시미에 대하여 real-time PCR 보다 3M MDA 2가 더 검출효율이 높음을 알 수 있었다. 분리배지가 가장 검출효율이 높았지만 3M MDA 2와 큰 차 이가 없었다. 배지를 사용하는 방법은 최소 일주일의 시간이 소요되고 PCR의 경우 inhibitor의 영향을 많이 받아 정확한 검출이 어려운 점이 있다. 그러나 LAMP에 기반한 3M MDA 2는 enrichment 후 다음 날 간단한 protocol을 통해 25분 이내로 샘플의 양성 반응을 확인할 수 있어 식중독균에 대해 신속하고 정확한 검출이 가능한 것으로 판단되었다.

In the case of foot-and-mouth disease (FMD), there is a great deal of impact on the national economy due to the disposal of diseases, the cost of disease control such as vaccination, reduction of productivity, and restriction of international trade of livestock products. Therefore, appropriate diagnostic methods for sensitive, accurate and rapid identification of virus serotypes are continuously required in terms of early prevention of FMD. This study was conducted to confirm the feasibility of immuno-PCR diagnostic method for the more sensitive detection of Korean FMD virus (FMDV). We synthesized a partial FMD type A viral gene. Protein antigen, monoclonal and polyclonal antibodies of FMDV were cloned, expressed and purified and then magnetic particles were attached to polyclonal antibodies and and oligomers to monoclonal antibodies for the immnuno-PCR. We confirmed the antigen-antibody and oligomer reaction using ELISA, Western blot, and real-time PCR. These results show that Korean FMDV can be detected by using difference of Ct values between positive group and negative group using immuno-PCR.. The results of this study also suggest that this technique will be the basis of the diagnosis method to detect Korean FMDV more sensitively in the future.

Leuconostoc spp. are generally utilized as kimchi starters, because these strains are expected to have beneficial effects on kimchi fermentation, including improvement of sensory characteristics. Here, we developed a detection method for verifying the presence of the kimchi starter Leuconostoc mesenteroides WiKim33, which is used for control of kimchi fermentation. A primer set for multiplex polymerase chain reaction was designed based on the nucleotide sequence of the plasmids in strain WiKim33, and their specificity was validated against 45 different strains of Leuconostoc spp. and 30 other strains. Furthermore, the starter strain consistently tested positive, regardless of the presence of other bacterial species in starter kimchi during the fermentation period. Our findings showed that application of a strain-specific primer set for strain WiKim33 presented a rapid, sensitive, and specific method for detection of this kimchi starter strain during natural kimchi fermentation.