Salmonella spp.는 식중독의 주요 원인균으로, 신속하고 정확한 검출 방법이 요구된다. 본 연구에서는 간소화된 direct multiplex real-time PCR 방법인 FS Finder SL키트 의 분석법 활용 가능성을 평가하고, 평판배지법과의 검출 성능을 비교하였다. 또한, real-time PCR의 검출 효율을 평 가하기 위해 FS Finder SL 키트에서 제공하는 세 가지 전 처리 방법(Method 1, 2, 3)을 비교 분석하였다. 실험 결과, 세 가지 전처리 방법을 이용한 direct multiplex real-time PCR 방법은 Salmonella spp.를 100% 검출할 수 있었으며, Ct 값 비교를 통한 통계적 분석에서도 세 방법 간 유의한 차이가 없는 것으로 나타났다(P>0.05). 반면, 선택 배지를 이용한 검출에서는 2 log CFU/g 이상으로 접종된 샘플에 서만 Salmonella spp.가 검출되었으나 real-time PCR법의 경우 0-3 log CFU/g 범위의 샘플에서 모두 검출이 가능 하였다. 또한, 실험에 사용된 세 가지 즉석섭취식품군(알 가공품, 닭가슴살 제품, 편의점 도시락)에서 자연균총의 영 향을 평가한 결과, 도시락 샘플의 일반세균수가 3.56±0.18 log CFU/g으로 가장 높았으며, 알가공품과 닭가슴살 제품 에서는 검출되지 않았다. 결론적으로 FS Finder SL 키트 를 활용한 real-time PCR 방법은 기존의 평판배지법보다 높은 검출 감도를 보였으며, 검출까지의 소요 시간을 대 폭 단축할 수 있었다. 특히, 복합적인 식품 매트릭스에서 도 신속하고 정밀한 검출이 가능함을 확인하였다. 본 연 구는 즉석섭취식품 중 Salmonella spp. 검출을 위한 효율 적인 direct multiplex real-time PCR 분석법의 적용 가능 성을 제시하며, 향후 식품안전 관리 시스템에서 활용될 수 있는 기초 자료를 제공한다.

The Japanese encephalitis virus (JEV) is a zoonotic pathogen that affects the nervous systems of humans, pigs, and horses. It has been classified into five genotypes (G1-G5) based on molecular analysis of the pre-membrane or envelope gene. In the Republic of Korea, the predominant JEV genotype has recently shifted from G3 to G1 and G5, highlighting the need for a rapid and accurate diagnostic method. In this study, we designed specific common and differential primer sets for JEV G1, G3, and G5 to detect the JEV gene. Four specific primer sets for JEV G1, G3, and G5 were used to selectively amplify the target gene. The detection limits of the common primer set for JEV G1, G3, and G5 were 100, 0.1, and 10 TCID50/reaction, respectively. The detection limits of the three differential primer sets were 1, 0.1, and 1 TCID50/reaction, respectively. No cross-reactivity was observed with non-JEV reference viruses. We successfully developed a multiplex reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay to distinguish the three JEV genotypes. Our multiplex RT-PCR assay is highly sensitive and specific, providing a reliable tool for confirming JEV infection in suspected samples. Additionally, our assay can be applied to suspected mosquito samples and commercial veterinary biological products.

본 연구에서 multiplex PCR과 real-time PCR을 이용하여 창난젓의 원료를 감별할 수 있는 새로운 판별법을 개발하였다. 명태와 가이양의 종 특이 프라이머를 디자인하고, 명태와 가이양의 genomic DNA를 template로 single PCR과 multiplex PCR을 실시하였다. PCR을 실시한 결과, single PCR에서 명태(297 bp)와 가이양(132 bp)에 해당하는 PCR 밴드를 확인하였으며 교차 반응이 일어나지 않는 것을 확인하였다. Multiplex PCR에서 명태와 가이양 사이에 교차 반응없이 증폭이 일어나는 것을 확인하였다. Real-time PCR 결과, 명태 종 판별 프라이머에서 명태의 Ct 평균값은 20.765±0.691, 가이양 시료에서 Ct 평균값은 35.719±1.828이 었으며, 가이양 종 판별 프라이머에서 명태 시료의 Ct 평균 값은 35.996±1.423, 가이양 시료의 Ct 평균값은 20.096±0.793 으로 프라이머의 효율성, 특이성 및 교차 반응성에서 유의한 차이가 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로 시중에서 판매되는 7개 제품을 multiplex PCR 및 real-time PCR로 확인 하였으며, 모든 시료에서 유효한 결과를 확인하였다. 본 연구에서 제작된 명태와 가이양에 대한 종 특이적 프라이머는 가공된 젓갈 시료의 원료의 판별 가능하며, 이러한 결과는 식품안전관리에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Staphylococcus aureus와 Bacillus cereus는 식중독을 일으키는 주요한 원인균 중 하나로 각종 식품에서 검출되면서 많은 주의가 요구되고 있다. 식중독 발생의 원인균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 여러 가지 방법 중 DNA 분석을 기반으로 하는 PCR 검출법이 보편적으로 사용되고 있다. 본 연구에서는 샌드위치와 같은 즉석 섭취 식품에서 식중독을 유발할 수 있는 S. aureus와 B. cereus 의 신속검출을 위해 conventional PCR과 real-time PCR의 특이도 및 민감도를 비교하였다. 그 결과, 검출한계 범위가 배양액에서는 cPCR의 경우 S. aureus (104-106 CFU/mL), B. cereus (103-105 CFU/mL) 이였고, real-time PCR의 경우 S. aureus (103-106 CFU/mL), B. cereus (102-105 CFU/mL) 이였다. 식품에서는 cPCR의 경우 S. aureus (104-106 CFU/mL), B. cereus (103-105 CFU/mL) 이고, real-time PCR의 경우 S. aureus (104-106 CFU/mL), B. cereus (103-105 CFU/mL) 으로 나타났다. Real-time PCR법이 cPCR법 보다 10배 이상 더 민감한 것으로 나타났다. 따라서 real-time PCR은 우수한 민감도를 지닌 검출기법으로 식중독 세균 검출에 있어 매우 효과적인 방법으로 사료된다.

느타리 품종구분을 위한 마커의 개발을 위하여 곤지7호 의 어버이 일핵 균사중의 하나인 MT07156-97의 전체 유전자 염기서열을 바탕으로 제작한 251개의 SSR 프라이머를 제작하였다. 우선적으로 수한1호, 곤지7호, 흑타리 품종에 다형성 여부를 관찰하여 20개의 SSR을 선발하고, 이를 10개 품종에 적용하였다. 단일의 프라이머로는 일부 품종이 구분되지 않았으므로, 선발된 프라이머 간의 다양한 조합(multiplex 방식)을 적용한 결과 모든 품종을 판별 할 수 있는 분자마커 다형성을 보인 프라이머 "166+115" 조합을 선발하였다. 별도로 프라이머 115와 166가 만들어 낸 산술적인 유전자좌(loci) 31개보다 12개 많은 40개의 유전자좌가 증폭되어 다양한 품종에 특이적인 분자마커를 제공할 수 있었다. 개발된 분자마커는 종균의 품질관리, 품종의 판별, 신품종 보호에 활용될 수 있을 것이다.

참돔은 등쪽에 푸른 반점이 흩어져 있고, 홍민어는 꼬리 쪽에 검은 점이 있어 원물 형태는 쉽게 구분할 수 있다. 그러나 횟감이나 필렛으로 이용 시 참돔과 홍민어를 구분하기 어려워, 참돔의 종 특이 primer를 개발 및 검증하고 모니터링을 통해 참돔의 위변조 사례를 조사하고자 하였다. 시료에서 gDNA를 추출하여 PCR을 진행하였으며 참돔 primer의 product size는 468 bp, 홍민어 primer의 product size는 181 bp으로 설계하였다. Multiplex PCR 결과 참돔과 홍민어에 대한 종 특이적 증폭이 확인되었다. 또한, 참돔과 홍민어 PCR 민감도 실험 결과 참돔 primer는 1 ng, 홍민어 primer는 0.1 ng 까지 밴드가 확인되었다. 모니터링 결과 참돔으로 구매한 시료 19건 모두 참돔으로 판정되었다. 따라서 본 연구에서 제작된 참돔과 홍민어 종에 대한 종 특이적 primer는 횟감 등 수산물에도 적용할 수 있어 현재 유통 및 판매되고 있는 참돔 및 홍민어 판 별에 적합성을 확인하였다.

Leuconostoc spp. are generally utilized as kimchi starters, because these strains are expected to have beneficial effects on kimchi fermentation, including improvement of sensory characteristics. Here, we developed a detection method for verifying the presence of the kimchi starter Leuconostoc mesenteroides WiKim33, which is used for control of kimchi fermentation. A primer set for multiplex polymerase chain reaction was designed based on the nucleotide sequence of the plasmids in strain WiKim33, and their specificity was validated against 45 different strains of Leuconostoc spp. and 30 other strains. Furthermore, the starter strain consistently tested positive, regardless of the presence of other bacterial species in starter kimchi during the fermentation period. Our findings showed that application of a strain-specific primer set for strain WiKim33 presented a rapid, sensitive, and specific method for detection of this kimchi starter strain during natural kimchi fermentation.

Mycoplasma (M.) felis and M. canis is related with pneumonia or conjunctivitis in domestic cats and several diseases in a variety of other animals, including lower respiratory tract disease or pleuritis. Polymerase chain reaction (PCR) assays has been reported as an easy and useful method. It could be conducted even on nasal swab samples as a non-invasive rapid testing tools for large numbers of Mycoplasma species. However, PCR assays have to conduct multiple assays because of a lot of Mycoplasma species. Therefore, it need to perform several tests and reveal time consuming procedures. In this study, we developed a sensitive and specific multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay that detects simultaneously two species like as M. felis and M. canis. The simultaneous detection of M. felis and M. canis primers were used to differentiate two mycoplasma species. The target DNA fragments were specifically amplified M. felis and M. canis PCR with 16S ribosomal DNA primers. Single and mixed Mycoplasma species DNA templates were submitted to validate the specificity of the multiplex PCR. The corresponding specific DNA products were amplified for each pathogen. The detection limit of the developed multiplex PCR is 102 pg with M. felis and M. canis DNA. Furthermore, the developed multiplex PCR detected successfully M. felis in feline nasal specimens. The multiplex PCR assay provides a novel tool for simultaneous detection and differentiation of M. felis and M. canis in cats.

The purpose of this study is to develop the quantitative PCR(qPCR) assay that would enable the rapid identification and simultaneous detection of six different endodontic pathogenic bacteria in a single reaction. In this study, six pairs of primers for Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Streptococcus mutans, and Staphylococcus aureus and two pairs of housekeeping genes were designed for a multiplex qPCR based on the SYBR Green method. The genomic DNA was extracted from reference strains and submitted to the qPCR reaction. The specificity of the amplified products was analyzed by melting curves. As a result, six distinct melting peaks were identified by the melting curve analysis and all of the target species were simultaneously discriminated. Therefore, the multiplex qPCR assay developed in this study can be used for rapid identification and detection of T. denticola, P. gingivalis, F. nucleatum, P. intermedia, S. mutans, and S. aureus at the same time. In combination with the melting curve analysis, the level of the target species and total bacterial load can be obtained.

Monochamus alternatus (M. alternatus) and Monochamus saltuarius (M. saltuarius) are major vectors for Bursaphelenchus xylophilus in South Korea. When an adult, they are easily distinguishable by several morphological classification. However, it is difficult to identification between M. alternatus and M. saltuarius when they are larvae as they have very similar morphological characters. Thus, they are not easily distinguishable without expertise about Cerambycidae taxonomy. Furthermore, during epidemiological investigation, sometimes, adults or larvae would not be founded in death pine trees. For these reasons, in this experiment, we are able to identified between M. alternatus and M. saltuarius by mitochondrial 12S rRNA gene primers that are specific to 12S rRNA gene fragment of M. alternatus using larvae tissue and frass. Moreover, we had examined whether vectors that were already escaped from dead pine tree have Bursaphelenchus xylophilus or not by multiplex PCR using larva frass that was remained in dead pine tree.

It is difficult to identification between Bursaphelenchus spp. and Pine Wood Nematode (PWN) by morphological characteristics without expertise about nematode taxonomy. Furthermore, Baermann funnel method, which is nematode extraction method from wood chips or soil, requires at least 24 hours to extract nematode that is unsuitable to rapid diagnose the Pine Wilt Disease (PWD). For these reasons, the aim of this experiment is not only to improve accuracy of a PCR based method but also to reduce total experiment time for detection Bursaphelenchus spp. and PWN in the wood chips of PWD infected pine tree. In this experiment, we had been employed two PCR primer sets, which were originated from PWN specific Internal Transcribed Spacer (ITS) sequence region and Bursaphenchus spp. universal mitochondrial Cytocrome Oxidase subunit I (mtCOI) sequence region in order to discrimination between Bursaphelenchus spp. and PWN at the same PCR reaction. This experimental procedure was able to reduce experiment time and cost as well as to improve accuracy of detection than previous PCR based detecting method by not using Baermann funnel method and commercial genomic DNA extraction kit but using direct pine wood chips lysis method.

본 연구에서는 국내 대표 식육인 소, 돼지, 닭, 오리의4종 식육과 염소, 양, 말, 칠면조의 4종 식육을 동시에 신속하게 감별할 수 있는 2 set의 multiplex PCR법을 개발하고자 미토콘드리아 16S RNA에서 종 특이부위를 선발하고 각 종에 대한 특이도를 높이기 위하여 인위적인 미스매치를 주어 프라이머를 제작한 후 8종 식육의 274개시료를 대상으로 특이도와 민감도를 조사하였다. 그 결과소, 돼지, 닭, 오리 모든 시료에서 각각 279, 94, 192, 477 bp의 증폭산물이, 말, 양, 염소, 칠면조의 모든 시료에서 각각 152 bp, 271 bp, 670 bp, 469 bp에서 뚜렷한 PCR 유전자 산물이 확인되어 모든 축종에서 100%의 특이도를 나타내어 축종별 감별력이 우수한 것으로 나타났다. 8종의 축종별로 DNA를 10 ng/μl으로 정량한 후 혼합물을 10배씩 단계 희석하여 반응여부를 조사한 결과, 소, 돼지, 오리에서는 100 fg까지, 닭에서는 1 pg까지 검출됨을 확인할수 있었다. 소, 돼지, 닭, 오리고기를 99.9%, 99%, 90%,70%, 50%, 30%, 10%, 1%, 0.1%의 비율로 혼합한 식육과 83℃ 20분, 100℃ 30분, 121℃ 10분에서 각각 열처리한 가열 혼합육에 대하여 검출한계를 조사한 결과 마지막단계의 희석 비율인 모든 혼합육의 0.1%에서 검출이 가능하였으며, 열처리 혼합육에서는 닭에서는 1% 농도에서소와 돼지의 혼합육에서 0.1% 농도에서 검출되어 민감도가 높음을 확인할 수 있었다. 본 연구에서 개발된 multiplex PCR법은 특이도 및 민감도에 있어서 국내 대표 식육을 감별하는데 있어서 유용한 것으로 평가된다.

Differentiation of Pleurotus eryngii is laborious and time-consuming tasks especially in mycelial status. For development of a method for differentiation of P. eryngii cultivars, simple sequence repeats (SSR) from whole genomic DNA sequence analysis was used for genotyping and two multiplex-SSR primer sets were developed. These SSR primer sets were employed to distinguish 12 cultivars and strains. Five polymorphic markers were selected based on the genotypes. PCR with the each primer produced one to four distinct bands ranging in size from 200 to 300 bp. Polymorphism information content (PIC) values of the five markers were in range of 0.6627 to 0.6848 with an average of 0.6775. Unweighted pair-group method with arithmetic mean clustering analysis based on genetic distances using five SSR markers classified 12 cultivars into 2 clusters. Cluster I and II comprised of 4 and 8 cultivars, respectively. Two multiplex sets, Multi-1 (SSR312 and SSR366) and Multi-2 (SSR178 and SSR277) completely discriminated 12 cultivar and strains with 21 allele with a PIC value of 0.9090. These results might be useful to provide an efficient method for the identification of P. eryngii cultivars with separate PCR reactions. (This work was supported by a grant from the Gold Seed Project [Supported by a grant from the IPET (213003-04-3-WTI11), MIFAFF, Republic of Korea.]

The purpose of this multiplex PCR assay is establishment and application for rapid and simultaneous detection of six pathogens related with insect diseases. Five pathogens were chosen based on the insect disease incidence rate in South Korea and specific primers of those pathogen were designed to detect insect diseases and test multiplex PCR for detecting Fungi; Beauveria bassiana(Bb), Metarhizium anisopliae(Ma), Bacteira; Bacillus thuringiensis(Bt), Pseudomonas aeruginosa(Pa), and Serratia marcescens(Sm). This research carried out the results detecting five kinds of insect pathogen of P. b. seulensis by multiplex PCR. Multiplex PCR is effective and save time to detect simultaneously these insect pathogens and multiple infections to prevent insect disease. In our study, using multiplex PCR, we demonstrated that P. b. seulensis was frequently infected with S. marcescens and co-infected with M. anisopliae in more than 80% of cases, indicating that such an analysis can be useful for pathogen identification, especially if different pathogens produce similar symptoms.

본 연구에서는 오징어류에 해당하는 대왕오징어, 오징어, 문어, 한치 및 이를 이용한 가공식품에 대해서 분자생물 학적 기법을 활용한 시험법을 검토하였다. 시료 중 원료 성분 확인을 위하여 오징어류 4종에 대해 최적의 종 특이 프라이머를 디자인하였으며, 시료로부터 직접 genomic DNA를 추출하여 PCR을 실시하였다. PCR 수행과정에서 반응을 저해하는 염 성분을 제거하기 위하여 증류수를 이용하여 3~4회 세척 후 PCR을 실시한 결과, Single PCR의 경우 대왕오징어(552 bp), 오징어(463 bp), 문어(247 bp), 한치(354 bp)에 해당하는 종 특이적인 증폭산물을 확인하였으며, Multiplex PCR 의 경우 서로 다른 종 사이의 교차반응없이 동시다발적으로 증폭이 일어남을 확인할 수 있었다. 또한 이들 4종에 대해 PCR 민감도를 조사한 결과, 모두 약 0.1 ng/μl의 농도까지 검출이 가능함을 확인하였으며 multiplex PCR의 경우 약 0.25 ng/μl의 농도까지 검출이 가능함을 확인하였다. 이를 이용하여 오징어류가 함유된 수산물 가공식품 8건에 대해 적용성을 검토한 결과, 모든 시료에서 유효한 결과를 확인할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 제작된 오징어류 4종에 대한 종 특이적 프라이머는 생물 상태뿐만 아니라 수산물 가공식품에 대해서도 이를 판별할 수 있어 식품안전관리에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.