본 연구에서 multiplex PCR과 real-time PCR을 이용하여 창난젓의 원료를 감별할 수 있는 새로운 판별법을 개발하였다. 명태와 가이양의 종 특이 프라이머를 디자인하고, 명태와 가이양의 genomic DNA를 template로 single PCR과 multiplex PCR을 실시하였다. PCR을 실시한 결과, single PCR에서 명태(297 bp)와 가이양(132 bp)에 해당하는 PCR 밴드를 확인하였으며 교차 반응이 일어나지 않는 것을 확인하였다. Multiplex PCR에서 명태와 가이양 사이에 교차 반응없이 증폭이 일어나는 것을 확인하였다. Real-time PCR 결과, 명태 종 판별 프라이머에서 명태의 Ct 평균값은 20.765±0.691, 가이양 시료에서 Ct 평균값은 35.719±1.828이 었으며, 가이양 종 판별 프라이머에서 명태 시료의 Ct 평균 값은 35.996±1.423, 가이양 시료의 Ct 평균값은 20.096±0.793 으로 프라이머의 효율성, 특이성 및 교차 반응성에서 유의한 차이가 나타났다. 이러한 결과를 바탕으로 시중에서 판매되는 7개 제품을 multiplex PCR 및 real-time PCR로 확인 하였으며, 모든 시료에서 유효한 결과를 확인하였다. 본 연구에서 제작된 명태와 가이양에 대한 종 특이적 프라이머는 가공된 젓갈 시료의 원료의 판별 가능하며, 이러한 결과는 식품안전관리에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Staphylococcus aureus와 Bacillus cereus는 식중독을 일으키는 주요한 원인균 중 하나로 각종 식품에서 검출되면서 많은 주의가 요구되고 있다. 식중독 발생의 원인균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 여러 가지 방법 중 DNA 분석을 기반으로 하는 PCR 검출법이 보편적으로 사용되고 있다. 본 연구에서는 샌드위치와 같은 즉석 섭취 식품에서 식중독을 유발할 수 있는 S. aureus와 B. cereus 의 신속검출을 위해 conventional PCR과 real-time PCR의 특이도 및 민감도를 비교하였다. 그 결과, 검출한계 범위가 배양액에서는 cPCR의 경우 S. aureus (104-106 CFU/mL), B. cereus (103-105 CFU/mL) 이였고, real-time PCR의 경우 S. aureus (103-106 CFU/mL), B. cereus (102-105 CFU/mL) 이였다. 식품에서는 cPCR의 경우 S. aureus (104-106 CFU/mL), B. cereus (103-105 CFU/mL) 이고, real-time PCR의 경우 S. aureus (104-106 CFU/mL), B. cereus (103-105 CFU/mL) 으로 나타났다. Real-time PCR법이 cPCR법 보다 10배 이상 더 민감한 것으로 나타났다. 따라서 real-time PCR은 우수한 민감도를 지닌 검출기법으로 식중독 세균 검출에 있어 매우 효과적인 방법으로 사료된다.

참돔은 등쪽에 푸른 반점이 흩어져 있고, 홍민어는 꼬리 쪽에 검은 점이 있어 원물 형태는 쉽게 구분할 수 있다. 그러나 횟감이나 필렛으로 이용 시 참돔과 홍민어를 구분하기 어려워, 참돔의 종 특이 primer를 개발 및 검증하고 모니터링을 통해 참돔의 위변조 사례를 조사하고자 하였다. 시료에서 gDNA를 추출하여 PCR을 진행하였으며 참돔 primer의 product size는 468 bp, 홍민어 primer의 product size는 181 bp으로 설계하였다. Multiplex PCR 결과 참돔과 홍민어에 대한 종 특이적 증폭이 확인되었다. 또한, 참돔과 홍민어 PCR 민감도 실험 결과 참돔 primer는 1 ng, 홍민어 primer는 0.1 ng 까지 밴드가 확인되었다. 모니터링 결과 참돔으로 구매한 시료 19건 모두 참돔으로 판정되었다. 따라서 본 연구에서 제작된 참돔과 홍민어 종에 대한 종 특이적 primer는 횟감 등 수산물에도 적용할 수 있어 현재 유통 및 판매되고 있는 참돔 및 홍민어 판 별에 적합성을 확인하였다.

Leuconostoc spp. are generally utilized as kimchi starters, because these strains are expected to have beneficial effects on kimchi fermentation, including improvement of sensory characteristics. Here, we developed a detection method for verifying the presence of the kimchi starter Leuconostoc mesenteroides WiKim33, which is used for control of kimchi fermentation. A primer set for multiplex polymerase chain reaction was designed based on the nucleotide sequence of the plasmids in strain WiKim33, and their specificity was validated against 45 different strains of Leuconostoc spp. and 30 other strains. Furthermore, the starter strain consistently tested positive, regardless of the presence of other bacterial species in starter kimchi during the fermentation period. Our findings showed that application of a strain-specific primer set for strain WiKim33 presented a rapid, sensitive, and specific method for detection of this kimchi starter strain during natural kimchi fermentation.

Mycoplasma (M.) felis and M. canis is related with pneumonia or conjunctivitis in domestic cats and several diseases in a variety of other animals, including lower respiratory tract disease or pleuritis. Polymerase chain reaction (PCR) assays has been reported as an easy and useful method. It could be conducted even on nasal swab samples as a non-invasive rapid testing tools for large numbers of Mycoplasma species. However, PCR assays have to conduct multiple assays because of a lot of Mycoplasma species. Therefore, it need to perform several tests and reveal time consuming procedures. In this study, we developed a sensitive and specific multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay that detects simultaneously two species like as M. felis and M. canis. The simultaneous detection of M. felis and M. canis primers were used to differentiate two mycoplasma species. The target DNA fragments were specifically amplified M. felis and M. canis PCR with 16S ribosomal DNA primers. Single and mixed Mycoplasma species DNA templates were submitted to validate the specificity of the multiplex PCR. The corresponding specific DNA products were amplified for each pathogen. The detection limit of the developed multiplex PCR is 102 pg with M. felis and M. canis DNA. Furthermore, the developed multiplex PCR detected successfully M. felis in feline nasal specimens. The multiplex PCR assay provides a novel tool for simultaneous detection and differentiation of M. felis and M. canis in cats.

The purpose of this study is to develop the quantitative PCR(qPCR) assay that would enable the rapid identification and simultaneous detection of six different endodontic pathogenic bacteria in a single reaction. In this study, six pairs of primers for Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Streptococcus mutans, and Staphylococcus aureus and two pairs of housekeeping genes were designed for a multiplex qPCR based on the SYBR Green method. The genomic DNA was extracted from reference strains and submitted to the qPCR reaction. The specificity of the amplified products was analyzed by melting curves. As a result, six distinct melting peaks were identified by the melting curve analysis and all of the target species were simultaneously discriminated. Therefore, the multiplex qPCR assay developed in this study can be used for rapid identification and detection of T. denticola, P. gingivalis, F. nucleatum, P. intermedia, S. mutans, and S. aureus at the same time. In combination with the melting curve analysis, the level of the target species and total bacterial load can be obtained.

Monochamus alternatus (M. alternatus) and Monochamus saltuarius (M. saltuarius) are major vectors for Bursaphelenchus xylophilus in South Korea. When an adult, they are easily distinguishable by several morphological classification. However, it is difficult to identification between M. alternatus and M. saltuarius when they are larvae as they have very similar morphological characters. Thus, they are not easily distinguishable without expertise about Cerambycidae taxonomy. Furthermore, during epidemiological investigation, sometimes, adults or larvae would not be founded in death pine trees. For these reasons, in this experiment, we are able to identified between M. alternatus and M. saltuarius by mitochondrial 12S rRNA gene primers that are specific to 12S rRNA gene fragment of M. alternatus using larvae tissue and frass. Moreover, we had examined whether vectors that were already escaped from dead pine tree have Bursaphelenchus xylophilus or not by multiplex PCR using larva frass that was remained in dead pine tree.

It is difficult to identification between Bursaphelenchus spp. and Pine Wood Nematode (PWN) by morphological characteristics without expertise about nematode taxonomy. Furthermore, Baermann funnel method, which is nematode extraction method from wood chips or soil, requires at least 24 hours to extract nematode that is unsuitable to rapid diagnose the Pine Wilt Disease (PWD). For these reasons, the aim of this experiment is not only to improve accuracy of a PCR based method but also to reduce total experiment time for detection Bursaphelenchus spp. and PWN in the wood chips of PWD infected pine tree. In this experiment, we had been employed two PCR primer sets, which were originated from PWN specific Internal Transcribed Spacer (ITS) sequence region and Bursaphenchus spp. universal mitochondrial Cytocrome Oxidase subunit I (mtCOI) sequence region in order to discrimination between Bursaphelenchus spp. and PWN at the same PCR reaction. This experimental procedure was able to reduce experiment time and cost as well as to improve accuracy of detection than previous PCR based detecting method by not using Baermann funnel method and commercial genomic DNA extraction kit but using direct pine wood chips lysis method.

본 연구에서는 국내 대표 식육인 소, 돼지, 닭, 오리의4종 식육과 염소, 양, 말, 칠면조의 4종 식육을 동시에 신속하게 감별할 수 있는 2 set의 multiplex PCR법을 개발하고자 미토콘드리아 16S RNA에서 종 특이부위를 선발하고 각 종에 대한 특이도를 높이기 위하여 인위적인 미스매치를 주어 프라이머를 제작한 후 8종 식육의 274개시료를 대상으로 특이도와 민감도를 조사하였다. 그 결과소, 돼지, 닭, 오리 모든 시료에서 각각 279, 94, 192, 477 bp의 증폭산물이, 말, 양, 염소, 칠면조의 모든 시료에서 각각 152 bp, 271 bp, 670 bp, 469 bp에서 뚜렷한 PCR 유전자 산물이 확인되어 모든 축종에서 100%의 특이도를 나타내어 축종별 감별력이 우수한 것으로 나타났다. 8종의 축종별로 DNA를 10 ng/μl으로 정량한 후 혼합물을 10배씩 단계 희석하여 반응여부를 조사한 결과, 소, 돼지, 오리에서는 100 fg까지, 닭에서는 1 pg까지 검출됨을 확인할수 있었다. 소, 돼지, 닭, 오리고기를 99.9%, 99%, 90%,70%, 50%, 30%, 10%, 1%, 0.1%의 비율로 혼합한 식육과 83℃ 20분, 100℃ 30분, 121℃ 10분에서 각각 열처리한 가열 혼합육에 대하여 검출한계를 조사한 결과 마지막단계의 희석 비율인 모든 혼합육의 0.1%에서 검출이 가능하였으며, 열처리 혼합육에서는 닭에서는 1% 농도에서소와 돼지의 혼합육에서 0.1% 농도에서 검출되어 민감도가 높음을 확인할 수 있었다. 본 연구에서 개발된 multiplex PCR법은 특이도 및 민감도에 있어서 국내 대표 식육을 감별하는데 있어서 유용한 것으로 평가된다.

The purpose of this multiplex PCR assay is establishment and application for rapid and simultaneous detection of six pathogens related with insect diseases. Five pathogens were chosen based on the insect disease incidence rate in South Korea and specific primers of those pathogen were designed to detect insect diseases and test multiplex PCR for detecting Fungi; Beauveria bassiana(Bb), Metarhizium anisopliae(Ma), Bacteira; Bacillus thuringiensis(Bt), Pseudomonas aeruginosa(Pa), and Serratia marcescens(Sm). This research carried out the results detecting five kinds of insect pathogen of P. b. seulensis by multiplex PCR. Multiplex PCR is effective and save time to detect simultaneously these insect pathogens and multiple infections to prevent insect disease. In our study, using multiplex PCR, we demonstrated that P. b. seulensis was frequently infected with S. marcescens and co-infected with M. anisopliae in more than 80% of cases, indicating that such an analysis can be useful for pathogen identification, especially if different pathogens produce similar symptoms.

종자 등 유전자원의 국가간 교류는 새로운 병원균을 유입시켜 새로운 병을 일으키고 경제적인 손실을 극대화 시킬수 있는 원인을 제공하기 때문에 국가별로 검역이 더욱 강화되고 있는 실정이다. 그러한 연유로 국가별로는 자국에 존재하지 않은 유사한 병원균을 발견할 경우 종자도입을 막고 있어 불필요한 경제적 손실원인이 되기도 한다. 따라서 이러한 손실을 막기위해 각국에 검역소에서는 병원균의 형태적인 감별보다 더 정확한 검정기술이 시급한 실정이다. 본 연구에서는 다중PCR을 통하여 한번의 PCR 증폭으로 벼종자에 존재하는 벼흰잎마름병을 일으키는 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)과 세균성 줄무늬병을 일으키는 Xanthomonas oryzae pv.oryzicola (Xoc) 를 검출하고 이 두병원균을 판별할수 있는, 국제미작연구소가 최적화한 다중PCR 검정방법의 실질적 적용성 여부를 검증하기 위한 연구였다. 그 결과 51개의 비병원성이나 Xoo 또는 Xoc 와 유사하며 벼종자에서 분리된 균들은 다중PCR검정에서 어떤 밴드도 증폭하지 않은 반면, 대조구(positive control)에서는 알맞은 band size의 amplicon들을 증폭해냈다. 따라서 본 연구에 사용된 국제미작연구소에서 최적화된 다중 PCR방법 (IRRI-optimized multiplex PCR)은 벼종자에서 발견할수 있는 Xoo와 Xoc 의 존재 여부 뿐만 아니라 이들과 형태적으로 유사하나 비병원성균으로부터 구분해 내는데 탁월한 방법이었음을 확인할 수 있었다.

초위성체 표지인자는 가축에서 유전자 다양성, 개체식별 연구를 위한 유전자 마커로 활용되고 있지만 가축의 가금류에서는 이러한 연구가 미비한 실정이다. 이러한 문제를 해결하기 위해 닭에서의 초위성체 마커에 대한 유전정보를 확보하고 보다 정확하고 신속한 유전자 분석 방법의 개발이 필요하다. 본 연구의 목적은 12개의 초위성체 표지인자(MS Marker)를 1세트로 구성된 다중중합효소연쇄반응(Multiplex PCR)을 이용하여 닭의 대립유전자와 대립유전자 빈도 및 이형접합도을 결정하는 마커를 개발하는 것이다. 닭 96수를 이용하여 12개 MS marker를 분석한 결과, MS marker에 대한 대립유전자수는 평균 3.08개로 관찰되었다. 12개 초위성체 마커의 이형접합도은 평균 0.563이고 다형정보도(Polymrphism information content : PIC)는 0.482로 계산되었다. 이 결과는 전국적으로 닭의 유전자를 이용한 개체식별 및 친자감별에 이용하기 위한 기초자료 뿐만 아니라 닭 이력제를 정착시킬 수 있는 중요한 기술로 활용 될 수 있을 것이라 사료된다.

The swine is one of the most widespread mammalian throughout the whole world. Presently, many studies concer-ning microsatellites in swine, especially domestic pigs, have been carried out in order to investigate general diversity patterns among either populations or breeds. Until now, a lot of time and effort spend into a single PCR method. But simple and more rapid multiplex PCR methods have been developed. The purpose of this study is to develop a robust set of microsatellites markers (MS marker) for traceability and individual identification. Using multiplex-PCR method with 23 MS marker divided 2 set, various alleles occurring to 5 swine breed (Berkshire, Landrace, Yorkshire, Duroc and Korea native pig) used markers to determine allele frequency and heterozygosity. MS marker found 4 alle-les at SW403, S0227, SWR414, SW1041 and SW1377. The most were found 10 alleles at SW1920. Heterozygosity represented the lowest value of 0.102 at SWR414 and highest value of 0.861 at SW1920. So, it was recognized appro-priate allele frequency for individual identification in swine. Using multiplex-PCR method, MS markers used to determine individual identification biomarker and breed-specific marker for faster, more accurate and lower analysis cost. Based on this result, a scientific basis was established to the existing pedigree data by applying genetics additio-nally. Swine traceability is expected to be very useful system and be conducted nationwide in future.

Virus infections of the honeybee(Apis mellifera) have been increasingly investigated during the last decade. In general, honeybee viruses are widespread and most of them persist as inapparent infections. We screened honeybee colonies for the presence of several bee viruses, including deformed wing virus(DWV), black queen virus(BQCV), Kashmir bee virus(KBV), Israeli acute paralysis virus (IAPV), sacbrood virus(SBV), acute bee paralysis virus(ABPV), using uniplex RT-PCR. Frequently simultaneous infections with different viruses are diagnosed in seemingly healthy bee colonies. Therefore we developed a multiplex RT-PCR assay for the simultaneous detection of multiple bee viruses.

Tuberculosis (TB) is a significant disease for both humans and animals worldwide. The genus Mycobacterium includes several species that cause TB disease in humans and other animals. Amongst the members of the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC), M. tuberculosis is mainly a human pathogen, whereas M. bovis has a broad host range and is the principal agent responsible for TB in domestic and wild mammals. M. bovis also infects humans, causing zoonotic TB through ingestion, inhalation. M. bovis accounts for only a small percentage of the reported cases of TB in humans. In recent years, TB in farmed deer has become a disease as public health importance in several countries. Nowadays, there has been rapid outbreak of bovine TB in cattle and deer in Korea. Investigations are needed to elucidate the relative importance of M. bovis on TB incidence in humans, especially in Korea where bovine TB remains a problem. Also, the human sources as the cause of animal infection, M. tuberculosis from the farm workers also important for TB control of animals in Korea. Differentiation between the causative organisms may only be achieved by sophisticated laboratory methods involving bacteriological characteristics, biochemical properties, and routine resistance to pyrazinamide (PZA). M. bovis shows inherently resistant to PZA whereas M. tuberculosis is susceptible to PZA. In this study, we developed a multiplex-PCR assay based on a 12.7-kb fragment for the differential detection of M. bovis and M. tuberculosis. A total of 131 M. tuberculosis complex isolates were randomly obtained from cattle and deers that were PPD positive. they all yielded M. bovis. M. tuberculosis was not isolated from animals. and, a total of 25 M. tuberculosis complex isolates which is resistant to PZA were obtained from patient. PZA resistant MTC in humans was caused entirely by M. tuberculosis. The multiplex-PCR protocol was highly species-specific and time saving for identification of M. bovis and M. tuberculosis. This multiplex-PCR assay will be easily used as a routine monitoring tool in veterinary and medical laboratories.