국내 유통되는 반려동물 사료의 살모넬라 분석시 증균 배양법, 효소면역기법에 의한 분석, 종 특이 primer를 활 용한 PCR 방법을 활용하여 비교 평가하였다. 시료 175점 Salmonella spp. 검출 결과 증균배양법 및 종 특이 primer를 활용한 PCR 방법에 의한 검출 방법에서 2점의 시료(육포, 옥수수 글루텐)가 양성으로 확인되었고, 효소면역기법에 의한 검출방법에서는 1점의 시료(옥수수 글루텐)가 양성 으로 확인되었다. 증균배양법 및 효소면역기법에 의한 검 출방법에 비해 종 특이 primer를 활용한 PCR 방법을 적 용 할 경우 시료에서 분리된 균주의 종(species) 판별이 가 능하였다.

Widespread consumption of fresh-cut vegetables without cooking results in ingestion of major foodborne pathogens including Bacillus cereus. In this study, we aimed to develop a method to rapidly detect B. cereus in fresh-cut vegetables by combining commercial PCR analysis with enrichment of the pathogenic levels. A mixture of B. cereus strains (KCTC1013, KCTC1014, KCTC1092, KCTC1094, and KCTC3624) was inoculated on the surface of fresh-cut cabbage lettuce (20 g) and baby leafy vegetables (10 g) to concentration 1, 2, 3, 4, and 5 log CFU/g. Eighty milliliters of TSB with 0.15% polymyxin B was used for cabbage lettuce, and 90 mL of medium was used for baby leafy vegetables and incubated at 42oC for 0, 2, 3, 4, 5, 6, and 7 h. One milliliter of the enriched media was plated on mannitol-egg yolk-polymyxin agar for quantification, and another 1 mL was used for DNA extraction for PCR analysis. Additionally, the minimum number of sub-samples to be tested from a pack of fresh-cut vegetable samples was determined using 5 sub-samples. The results from this study showed that for detecting B. cereus in fresh-cut cabbage lettuce, 3, 4, 5, 6, and 7 h enrichment were required to at least detect 5, 4, 3, 2, and 1 log CFU/g of B. cereus, respectively. B. cereus in fresh-cut baby leafy vegetables could be detected after 2, 3, 4, 5, and 6 h of enrichment at 5, 4, 3, 2, and 1 log CFU/g, respectively, using a combination of enrichment and PCR analysis. To determine if a pack of fresh-cut vegetable is positive, the minimum number of sub-samples should be 3. These results can be used to develop a rapid detection method to semi-quantify B. cereus in fresh-cut vegetable samples combining enrichment and PCR.

식품에 존재하는 병원균을 신속검출하기 위한 방법으로 LAMP와 real-time PCR 방법을 비교 평가 하였다. S. Typhimurium, L. monocytogenes, C. sakazakii의 3종에 대해 식품공전에서 권고하는 식품 종류를 선별하여 민감도를 분석하였다. S. Typhimurium에서는 11종의 식품(햄, 닭가슴살, 계란, 돼지고기, 소고기, 오리고기, 액상음료, 샐러드, 콘프레이크, 초콜릿, 사료)중 4종(햄, 돼지고기, 시리얼, 사료)에서 LAMP보다 real-time PCR에서 검출 민감도가 10 배 이상 더 높았고, 6종(닭가슴살, 계란, 소고기, 오리고기, 음료, 샐러드)에서는 real-time PCR과 비슷한 수준을 그리고 초콜릿에서는 real-time PCR로는 검출되지 않았으며 LAMP로만 검출되는 결과가 나타났다. L. monocytogenes 와 C. sakazakii에서는 9종 모두에서 LAMP보다 real-time PCR에서 검출 민감도가 더 높았다. 또한 L. monocytogenes 에서 LAMP의 검출 민감도가 S. Typhimurium과 C. sakazakii 보다 10배 이상 낮았다. 3M MDS의 검출한계 향상을 위해 변형된 3M MDS의 민감도는 기존대비 10배 이상 증가되었다. 따라서 식품에 존재하는 병원균의 검출 을 위해 식품의 구성성분에 따라 LAMP와 real-time PCR 를 적절히 선택하는 것이 바람직할 것으로 생각되었다. 한편, 농축 방법을 이용해 LAMP방법의 민감도를 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.

Salmonella는 전세계적으로 식중독을 유발하는 주요 원 인 균으로서, 식중독을 유발하는 Salmonella를 신속하게 검출하는 방법은 식품 안전을 위한 중요한 도구이다. Realtime PCR은 식중독균을 검출하기 위한 신속검사법으로 널 리 사용되어 왔다. 최근에는 NBS LabChip real-time PCR 이라는 새로운 시스템이 칩타입으로 조작이 간편하며 초 고속의 real-time PCR 시스템이라는 보고가 있었다. 본 연 구에서는 살모넬라의 신속한 검출을 위하여 NBS LabChip real-time PCR에 기반하여 real-time PCR 반응 시간이 20 분 이내인 검출법을 확인하고자 하였다. 프라이머와 프로 브 설계를 위해 두 개의 타겟 유전자(invA, stn)가 선택되 었으며, 특이도와 민감도(검출한계)를 평가함으로 개발된 검출법을 검증하고자 하였다. 본 연구에서는 특이도 검증을 위해 Salmonella 균주 42주와 Non-Salmonella 균주 21 주를 포함하였으며, 본 방법으로 Salmonella 42주에 대해 서만 정확하게 검출이 가능하였다. 검출한계는 살모넬라 genome DNA 기준으로 101 copies/μL 였으며, 소시지에서 는 4시간 증균 이후 접종균수로서 101CFU/g 에서 102 CFU/ g까지 검출이 가능하였다. 본 연구에서 개발된 검출법은 신속한 식중독 원인조사에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

The purpose of this study is to develop the quantitative PCR(qPCR) assay that would enable the rapid identification and simultaneous detection of six different endodontic pathogenic bacteria in a single reaction. In this study, six pairs of primers for Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Streptococcus mutans, and Staphylococcus aureus and two pairs of housekeeping genes were designed for a multiplex qPCR based on the SYBR Green method. The genomic DNA was extracted from reference strains and submitted to the qPCR reaction. The specificity of the amplified products was analyzed by melting curves. As a result, six distinct melting peaks were identified by the melting curve analysis and all of the target species were simultaneously discriminated. Therefore, the multiplex qPCR assay developed in this study can be used for rapid identification and detection of T. denticola, P. gingivalis, F. nucleatum, P. intermedia, S. mutans, and S. aureus at the same time. In combination with the melting curve analysis, the level of the target species and total bacterial load can be obtained.

Virus infections of the honeybee(Apis mellifera) have been increasingly investigated during the last decade. In general, honeybee viruses are widespread and most of them persist as inapparent infections. We screened honeybee colonies for the presence of several bee viruses, including deformed wing virus(DWV), black queen virus(BQCV), Kashmir bee virus(KBV), Israeli acute paralysis virus (IAPV), sacbrood virus(SBV), acute bee paralysis virus(ABPV), using uniplex RT-PCR. Frequently simultaneous infections with different viruses are diagnosed in seemingly healthy bee colonies. Therefore we developed a multiplex RT-PCR assay for the simultaneous detection of multiple bee viruses.

Deformed wing virus (DWV) is a serious pathogen of the honeybee, Apis mellifera L., vectored by the parasitic mite Varroa destructor. The virus is associated with wing deformity in symptomatic bees, and premature death and reduced colony performance in asymptomatic bees. In present study a novel micro PCR-based detection method, termed as ultra-rapid real-time PCR (UR-RT PCR), was developed for the fast and quantitative detection of DWV in honeybee. A specific detection primer set (DWV-UR-F3/R3) was used for the amplification of an unique 133-bp DNA fragment of DWV with a rapid real -time PCR system, GenSpector® TMC-1000, which proceed the cycling with fast heating and cooling rates and a small reaction volume. We showed that this method is able to detect DWV with DNA conditions, artificial recombinant DNA, pBX-DWV479 as well as with virus-infected honeybee samples. In application to a DWV-infected honey bee, the minimum detection time was 8 min 50 seconds under 30 cycles and 10min 11 seconds including melting temperature analysis. This optimizing detection method is one of the fastest real-time PCR-based diagnostic tools and is available to be applied to use for the detection in the field and of various persistency pathogens.

본 연구에서는 분자생물학적 방법을 통한 알레르기 유발 원재료 확인을 위해 PCR방법의 최적 조건을 구축하였 다. 가공식품에서 알레르기 원료성분 확인을 위하여 200bp 내외의 PCR 산물을 생성할 수 있는 종특이 프라이머를 설계하거나 선행연구사업 결과를 활용하였다. 대상 원료로는 국내 식품알레르기 표시대상인 난류, 우유, 메밀, 땅 콩, 대두, 밀, 고등어, 게, 새우, 돼지고기, 복숭아 및 토마 토와 제외국에서 알레르기 유발 성분으로 규정하고있는 아몬드, 참깨를 포함하여 총 14종을 대상으로 하였다. 특이 프라이머를 사용하여 PCR 한 결과 난류, 우유, 메밀, 땅콩, 대두, 밀, 고등어, 게, 새우, 돼지고기, 복숭아, 토마토, 아몬드 및 참깨로부터 각각 281, 131, 138, 120, 118, 127, 211, 174, 231, 138, 174, 132, 103 및 220bp의 특이 밴드를 확인하였으며 상호간의 비특이적 밴드는 검출되 지 않았다. 본 연구에서 확립한 알레르기 유발 원재료 검출법은 식품의 부정확한 표시나 가공식품의 제조과정 중 알레르기 유발물질의 비의도적 혼입 등으로부터 소비자를 보호하고 향후 수출 제품에 있어서 정확한 알레르기 유발 원재료 표기에 활용이 가능할 것으로 판단된다.

벼 흰잎마름병균의 정확한 진단을 위하여 PCR용 진단 kit를 개발하였다. 본 PCR kit를 개발하기 위하여 벼 흰잎마름 병균 유전체 정보 중 phage-related integrase and transposase gene의 염기서열을 이용하여 프라이머를 각각 제작하였다. 프라이머 염기서열은 XOP-F (5-CGG TCT GCT CAA TGA GGA AGA-3)와 XOP-R2 (5-TGC AAT TGG TGT TCTCCA GG-3), XOT-F (5-GTC ATA GGT GAG GCT TCCC-3)와 XOT-R2 (5-AGT GCG ATC TTT CAG CAG G-3)로 벼 흰잎마름병균의 DNA를 401bp와 492bp를 증폭하게 제작하였다. PCR 증폭은 벼 흰잎마름병균만 증폭하였으며 다른 세균인 Escherichia coli, Agrobacterim, Pectobacterium caratovora subsp. cartovorum, P. atrosepticum, Pseudomonasputida, P. syringae, P. savastanoi pv. phaeolicola, P. savastanoipv. savastanoi and P. marginalis pv. Marginalis 등은증폭되지 않아 특이성이 인정 되었다. 본 프라이머로 병이 의심되는 벼잎과 논물에서 병원균을 3시간 이내에 검출할 수 있었다.

현재 식중독 미생물의 검사에 전통적인 배지법이 다수를 차지하고 있으나 PCR이나 면역 분석법과 같은 신속 검출법들의 사용이 증가하는 추세이다. 그러나 대개 speciesspecific 프라이머를 이용한 PCR에 의한 DNA 증폭산물을 전기영동을 통해 확인하는 방법을 사용하고 있는데 이는 각종 균주에 대해 각기 다른 프라이머를 사용하여야하는 단점이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 본 연구에서는 여러 가지 균주를 동시에 신속하게 검지할 수 있도록 PCR-DGGE 기술을 연구하게 되었다. 그 결과 6종(S. typhimurium, P. fluorescens, B. cereus, S. aureus, E. coli, L. monocytogenes)의 유해 미생물을 선정하였고 DGGE 상에서 확실한 분리능을 보여 유해미생물의 인공마커로 사용할 수 있음을 보였다. 또한 실제 PCR-DGGE 기법을 사용하기 위하여 채소에서의 유해미생물 검출 감도를 확인한 결과 B. cereus를 제외한 5종(S. typhimurium, P. fluorescens, S. aureus, E. coli, L. monocytogenes)의 균들은 모두 101 CFU/g까지 검출할 수 있었고 B. cereus는 103 CFU/g이상 채소에 존재할 때 검출할 수 있었다. 또한 균질화 방법에 따라서 식물 DNA와 유해 미생물 간의 경쟁적 증폭현상이 일어남도 확인할 수 있었다. 이로써 본 연구에서는 유해 미생물의 검지, 인공마커의 제조, 식물 DNA와 유해미생물간의 경쟁적 증폭 현상 방지책과 유해미생물의 검출 감도 확인 및 염기서열을 통한 동정을 통해 PCR-DGGE가 식품에서 유해 미생물의 신속 검지 방법으로써 활용할 수 있을 것으로 사료된다. 향후 국내 식품소비 패턴이 유기농 채소의 수요와 공급이 날로 증대 되고 있기 때문에 PCR-DGGE 기법이 유기농 채소들의 식중독 균에 대한 database를 구축하여 안전성을 확보하는데 기여할 수 있다고 생각된다.

The infectious pathogens against honeybee (Apis mellifera) comprise a heterogeneous group of bacterial, viral, and fungal organisms including Paenibacillus larvae, Deformed Wing Virus (DWV) and Nosema apis. Many species like Paenibacillus larvae, Deformed Wing Virus (DWV) and Nosema apis have been isolated from a number of different continents, e.g. America, Asia and Europe, indicating its wide spread in whole nature. Little is known about the occurrence and distribution in the environment of these pathogens. For a more rapid, systematic and efficient monitoring of each pathogenic species against honeybee in the environment, PCR-based detection systems were developed that allows species-specific identifications of various pathogenic species with one reaction. These could be achieved by selecting specific primers from conserved regions of each species with speciesspecific DNA sequence variations. For the detection of any already known pathogen, well-developed PCR-detection system allows the specific detection of expected pathogenic species based on its specific nucleic acid sequence. Since each pathogenic species delivers a specific PCR-product of different size, bands can be distinguished very easily by simple gel electrophoresis. After the development of real-time PCR system, PCR-based specific detections of honeybee pathogens were dramatically improved their applications, from just detection to quantification of pathogens. These systems, quantitative PCR (qPCR) for the detection of honeybee pathogens, could be distinguished from previous PCR detection on the points of “real-time”, “easy” and “quantitative”. Moreover, very rapid PCR, so-called “Ultra-Rapid Real-Time PCR” were developed recently in field of pathogen-detection. Typical Honeybee pathogens such as Paenibacillus larvae, Israelli acute paralysis virus (IAPV) were successfully detected inner 7 minutes using 30 cycled Ultrarapid PCR. According to development of more rapid apparatus, even 30 cycled, 1 minute PCR seems to be possible. Ultla-Rapid PCR was currently attempted to apply for the direct detection system of all viral pathogens against honeybee from bee-samples and different environmental probes.

본 연구는 Lightcycler (Roche)를 이용한 Real-Time PCR(LC-PCR)기법을 통하여 원유시료에서 신속, 정확하게 황색포도상구균을 검출하는 기법을 개발하고자 하였다. coagulase 전구체를 coding하는 113 bp의 coa 유전자의 증폭, melting curve 분석 및 DNA염기서열을 분석하여 황색포도상구균 특유의 유전자 검출하는 기법을 개발하였다. 또한 분리된 균주중 메치실린에 내성을 나타내는 균주를 검출하고자 penicillin-binding protein, PBP2a (mecA)를 coding 하는 209 bp의 mecA 유전자의 증폭, melting curve 분석 및 DNA염기서열을 분석하여 메치실린내성 황색 포도상구균을 real-time PCR 기법으로 검출하는 기술을 개발하였다. 본 실험에 따르면 647개의 원유시료중 6개의 시료에서 황색포도상구균이 검출되었으며 이중 2개의 시료에서 분리된 황생포도상구균이 메치실린내성 황색포도상구균임을 확인하였다. 또한 DNA 검출한계는 10 fg으로 기존 PCR에 비해 매우 감도가 우수한 것을 확인하였다. 또한 3개의 원유시료에서 돼지나 소의 삼출성 피부염의 원인균인 Staphylococcus chromogenes가 분리되었다.