L-asparaginase (ASNase) is a therapeutic enzyme used to treat acute lymphoblastic leukemia. Currently, the most widely used ASNases are originated from bacteria. However, owing to the adverse effects of bacterial ASNases, new resources for ASNase production should be explored. Fungal enzymes are considered efficient and compatible resources of natural products for diverse applications. In particular, fungal species belonging to the genus Trichoderma are well-known producers of several commercial enzymes including cellulase, chitinase, and xylanase. However, enzyme production by marine-derived Trichoderma spp. remains to be elucidated. While screening for extracellular ASNase-producing fungi from marine environments, we found four strains showing extracellular ASNase activity. Based on the morphological and phylogenetic analyses using sequences of translation elongation factor 1-alpha (tef1α), the Trichoderma isolates were identified as T. afroharzianum, T. asperellem, T. citrinoviride, and Trichoderma sp. 1. All four strains showed different ASNase activities depending on the carbon sources. T. asperellem MABIK FU00000795 showed the highest ASNase value with lactose as a carbon source. Based on our findings, we propose that marine-derived Trichoderma spp. are potential candidates for novel ASNase production.

The button mushroom, Agaricus bisporus, is one of the major economical crops cultivated in Korea. This mushroom showed the 5th production to 11,493 M/T in 2014. Several fungus are known as the causal agents of diseases of the cultivated button mushroom (Agaricus bisporus) and oyster mushroom (Pleurotus ostreatus). Trichoderma harzianum is the causal agent of green mould disease of commercial mushrooms. Early symptoms were noticed as round, fleshy, brown lesions on mushroom caps. Late symptoms spread on the surface of the casing, and covered entirely fruiting bodies. A Gram-positive bacterium was isolated from mushroom media that markedly showed the antagonistic activity against Trichoderma harzianum, the destructive pathogen of cultivated mushrooms. The CH518 strain was selected as antagonistic bacterium by inhibition zone method and it was identified as Bacillus methylotrophicus by the cultural, morphological and physiological characteristics, and analysis of the 16S rDNA. The isolated bacterium is saprophytic but not parasitic nor pathogenic to cultivation mushroom. The isolated bacterium for Trichoderma harzianum cell, was sufficient for inhibition in vitro. Inoculation of the isolated bacterium prevents the development of bacterial disease in Trichoderma harzianum. Control efficacy of browning disease of strain CH518 treatment was 77.7% on Agaricus bisporus. The optimal culture medium for the antagonistic bacteria growth was determined as follows: 3.0% saccharose, 1.5% Soytone, 1% NH4H2PO4, 10 mM MgSO4, and 2.0% glutamic acid at pH 6.0 at 25°C. The suppressive bacterium may be useful in future for the development of biocontrol system and the construction of genetically modified edible fungi resistant to the disease caused by Trichoderma harzianum.

버섯배지의 발효를 효율적으로 행하면서 버섯의 재배 시 빈번하게 발생하는 푸른곰팡이 병의 원인 균주인 Trichoderma sp. 곰팡이 성장을 억제하는 세균의 분리를 행하였다. 균원시료로부터 1차 분리한 약 200여 균주 중에서 성장속도가 빠르고, SM, AM 및 CM의 평판배지 상에서 clear zone이 뚜렷한 6균주를 2차 분리하였다. 분리한 6균주 중 cellulase, amylase 및 protease의 효소활성이 높고 T. virens와 T. harzianum에 대하여 강한 항균활성을 나타낸 C-1균주를 최종 분리균주로 선정하였다. 분리한 C-1균주는 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 의한 동정과 16S rDNA 염기서열 분석을 행한 결과 Paenibacillus polymyxa 밝혀져 P. polymyxa CK-1으로 명명하였다. P. polymyxa CK-1균주의 생육조건을 검토한 결과 최적배양온도는 45˚C, 생육을 위한 배지의 최적 pH는 6.0~7.0 범위로 나타났다. T. virens와 T. harzianum 곰팡이의 생육억제를 위한 P. polymyxa CK-1의 배양시간은 22~36시간이 적당하였다. 그리고 P. polymyxa CK-1균주의 24시간째 배양용액을 처리한 petri dish에 두 곰팡이를 각각 접종한 후 10일 동안 방치하여도 곰팡이의 생육은 관찰되지 않았다. P. polymyxa CK-1 균주가 생산한 길항물질의 열안정성을 검토한 결과 60˚C 및 100˚C로 20분 동안 처리한 시험구에서는 두 곰팡이의 균사성장이 전혀 관찰되지 않았지만 121˚C에서 20분 동안 처리한 시험구에서는 약간의 균사성장이 관찰되었다. P. polymyxa CK-1배양액이 버섯균사 생육에 미치는 영향을 검토한 결과 팽이버섯, 표고버섯 등의 다양한 버섯균사 생육에 전혀 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

β-glucan 함량이 높다고 알려진 꽃송이버섯의 농가재배활성화를 위하여 푸른곰팡이 내성균주를 선발하고자 푸른곰팡이 대치배양에 의한 꽃송이버섯 균사생장 특성을 확인하였으며, 또한 생장이 우수한 신품종을 개발하고자 교잡육종 균주에 대한 유전 다양성을 분석하였다. 먼저 푸른곰팡이 대치배양에 의한 꽃송이버섯 균사의 생장 특성을 확인한 결과, 6951 (T. viride) 균주에서는 대치선을 형성한 후 별다른 변화를 보이지 않았고, 6952 (T. spp.) 균주에서는 대치선을 형성한 다음 보다 많은 포자를 형성하는 것이 관찰되었다. 그러나 6426 (T. harzianum) 균주에서는 꽃송이버섯 균사가 생장하고 있던 부분까지 모두 덮어버리는 것이 확인되었다. 그 중 특이하게도 구례에서채집선발한 균주인 JF02-06 균주에서는 다른 균주에 비해푸른곰팡이 포자가 형성되지 않는 것을 확인되어 다소 푸른곰팡이에 대한 저항성을 갖는 것으로 사료되었다. 전남산림자원연구소에서 보유 중인 균주 중 생장 및 자실체 발생이 우수한 모균주를 선발하여 교잡을 실시하여 생장특성을 조사한 결과, 미송톱밥배지에서 JF02-47, 49, 50 균주의 균사생장량이 우수한 것으로 확인되었다. 이러한 교잡육종 균주의 유전 다양성을 분석하기 위하여 ITS1, 5.8S와 ITS4 영역에 대한 염기서열을 분석한 결과 Genebank에 등록된 다른 꽃송이버섯 균주와 높은 유의성을 갖는 것으로 확인되었다. 이러한 꽃송이버섯의 포자 및 균사를 현미경으로 관찰하여 생장 특성을 확인한 결과, 포자의 크기는 장경 6µm, 단경 5µm의 물방울 모양으로 확인되었고,균사에서 3가지 형태의 꺽쇠가 관찰되었다. 균사의 폭은3µm이며 꽃송이버섯 균사의 특징으로는 약 50% 정도꺽쇠에서 균사가 뻗어나가는 특성을 갖고 있음이 확인되었다. 균사의 생장 속도는 0.507µm/min이며, 2차 균사는0.082µm/min의 속도로 생장하다가 모균사와 평행을 이루는 시점에서는 모균사의 생장속도와 유사한 속도로 생장하였다. 꺽쇠발생은 약 5시간 동안 균사 내부 전해질의이동이 관찰된 후 작은 꺽쇠를 형성하였다. 약 3시간 후격막이 형성되기 시작하였으며, 그로부터 2시간 후 최종적으로 완성되었다. 이러한 특성을 갖는 꽃송이버섯의 푸른곰팡이 저항성을 확인하고, 교잡균주의 유전 다양성 및균사의 생장 특성을 확인하여 꽃송이버섯에 대한 기초적인 이해를 높이고, 더 나아가 버섯산업 발전에 이바지하고자 한다.

최근 환경보존 및 안전한 먹거리의 필요성 증대에 따라 화학비료 및 농약 사용을 기피하는 대신에 수목으로부터 추출 분리된 항균력을 나타내는 화합물을 활용하려는 연구가 많이 수행 되고 있다. 식물정유는 terpene, alcohol, aldehyde 등과 같은 여러 가지 복합화합물로 식물의 이차 대사산물이며 외부환경에 대한 자체 방어기작으로 합성되는 생리활성물질로 항균, 살균 등 방부효과가 뛰어나고, 향이 후각을 통해 기억, 감정 등을 관장하는 대뇌변연계에 자극을 주기 때문에 스트레스나 긴장을 완화시키고 기억력과 면역력을 증가시키는 것으로 알려져 있 다. 따라서 수목으로부터 분리된 수용성정유를 이용하여 버섯에 병해를 일으키는 푸른곰팡이 병의 원인 미생물인 Trichoderma에 대한 항균활성을 확인하고자 본 연구는 시도되었다. 본 연구는 MA배지에 편백 수용성 정유와 시판화학약품을 농도별로 혼합하고 그린몰드 5종(T. aggressivum, T. atroviride, T. harzianum, T. koningii, T. viride)을 각각 접종한 후 생장시 켜 그린몰드 억제 성능을 비교 평가하였다. 편백나무 수용성정유의 항균활성은 T. aggressivum, T. atroviride 및 T. harzianum을 제외 하고 625 ppm - 5000 ppm의 농도에서 나타났으며, 5000 ppm의 농도에서 T. aggressivum 51.3%, T. atroviride 68.8%, T. harzianum 53.8%, T. koningii 51.7% 및 T. viride 53.0%의 항균활성이 확인되었다. 시판 화학약품은 T. aggressivum에 대하여 모든 농도에서 100%의 항균활성을 나타냈으며, 1000 ppm의 농도에서 T. atroviride, T. harzianum, T. koningii, T. virided에 대하여 60% 이상의 항균활성을 나타냈다. 편백나무 수용성정유의 휘발성 화합물 분석 결과, 15가지 화합물이 검출되었으며 주요 성분 으로는 Terpinen-4-ol 및 α-Terpineol이 각각 73.3% 및 7.23%로 가장 많이 함유되어있었으 며, 전체적으로 momoterpen류 약 93.3%, sesquiterpene류가은 약 6.7%를 차지하는 것을 확인 할 수 있었다.

Sephadex G-100 column chromatography에 의해 Trichoderma harzianum 유래 β-mannanase의 정제를 수행하여 비활성 8.44 units/mL 정제배율 56.27배를 나타내었다. SDS-PAGE에 의한 단일밴드를 확인하였고, 분자량은 52.5 kDa으로 결정되었다. 정제효소에 의해 Picea abies Galactosyl glucomannan을 가수분해하여 activated carbon column chromatography에 의해 당가수분해물을 분리 회수하여 TLC 및 Timell's method에 의해 중합도 6, 8, 9로 결정되었으며, Penicillum purpurogenum유래 정제 β-mannanase와 α-galactosidase를 이용한 enzymatic sequential action에 의해 3 가지 가수분해산물 모두 hetero type galactosyl glucomannooligosaccharides로 확인되었다. B. longum, B. bifidum, B. infantis, B. animalis, B. breve, B. adolessentis, B. auglutum의 생육활성에 대한 중합도 6, 8, 9의 영향을 검토하기 위하여 modified-MRS 배지상에 탄소원으로 중합도 6, 8, 9를 대체하여 생육활성을 비교한 결과 B. longum에서는 D.P. 6 galactosyl glucomannooligosaccharide를 탄소원으로 대체한 경우 표준 MRS배지와 비교하여 14.3배, D.P. 8에서 9.42배, D.P. 9에서 8.0배의 상대활성을 나타내어 가장 우수한 생육활성을 나타내었으며, B. breve의 경우에서도 D.P. 6에서 7.52배, D.P. 8에서 8.19배, D.P. 9에서 6.9배의 높은 활성을 보인 반면, B. bifidum에 대해서는 D.P. 6에서 2.33배, D.P. 8에서 1.33배, D.P. 9에서 2.33배의 낮은 생육활성을 나타내었다.

Compound K(ginsenoside M1) is one of saponin metabolites and has many benefits for human health. This study was to investigate Compound K produced from ginseng crude saponin extract with commercial cellulolytic complex enzyme(cellulase, β-glucanase, and hemicellulase) obtained from Trichoderma reesei. The effect factors(temperature, pH, ginseng crude saponin extract and enzyme concentration, and reaction time) on production of Compound K from ginseng crude saponin extract were determined by one factor at a time method. The selected major factor variables were ginseng crude saponin extract of 2%(w/v), enzyme of 7%(v/v), reaction time of 48 hr. Based on the effect factors, response surface method was proceeded to optimize the enzymatic bioconversion conditions for the desirable Compound K production under the fixed condition of pH 5.0 and 50℃. The optimal reaction condition from RSM was ginseng crude saponin extract of 2.38%, enzyme of 6.06%, and reaction time of 64.04 hr. The expected concentration of Compound K produced from that reaction was 840.77 ㎎/100 g. Production of Compound K was 1, 017.93 ㎎/100 g and 862.31 ㎎/100 g, by flask and bench-scale bioreactor(2.5ℓ) system, respectively.

Trichoderma harzianum 균사체를 Al2O3 입자와 마찰시킴으로써 Agrobacterium을 이용한 형질전환 에 효과적으로 이용할 수 있었다. Hygromycin 저항성 균사체 출현을 비교한 결과 형질전환 효율이 20% 정도로 나타났으며 대조군의 경우 형질전환균사체의 출현은 없었다. 2차례의 연속적인 항생제배지에서 선발을 거친 형질전환균사체들은 PCR에 의하여 안정적 DNA도입이 확인되었으며 RT-PCR에 의하여 target gene의 mRNA발현을 확인할 수 있었다. 현재까지 Agrobacterium을 이용한 T. harzianum 형질 전환은 보고된 바 없다.

품종 저항성 조사방법별로병원균과 버섯품종을 다르게 하여 품종간의 차이점이 있는지를 검토하였다. 푸른곰팡이 균과 품종별 대치배양시험에서 대치라인 형성, over growth, Lysis 증상이 나타났으며, 공시품종 중에 ASI 2183, ASI2504, ASI 2477 균주가 병저항성이 있을 것으로 판단되었다. 배양여액을 이용한 방법에서는 ASI 2240, ASI 2479, ASI 2181들이 저항성을 나타냈으며, 대치배양에서는 다른 경향을 보이는 경우도 있었으나, ASI 2479, ASI 2240 균주는 대치배양, 배양여액 시험결과에서 모두 저항성을 보였다. 배양후 접종법에서는 저항성을 보이는 버섯균주는 ASI 2479, ASI 2333, ASI 2181 등이었으며, 가장 감수성 품종은 큰느타리버섯인 ASI 2302 균주로 나타났다. 푸른곰팡이균주 같은 균주에서도 품종에 따라 각기 다른 특성을 나타냈으며, 동일품종에서 푸른곰팡이균주에 따라 각기 다른 병원성을 나타냈다. 느타리버섯과 푸른곰팡이균의 상호관계에서 다양한 증상이 발생하며 느타리버섯 품종에 대한 저항성 유무를 판단할 수 있다고 판단된다. 하지만 처리량이 많은 경우 동일 처리 내의 반복처리에서도 병징의 차이가 발생하는 경우가 있으며, 이는 시험에 사용한 버섯균과 병원균의 접종원의 활력의 차이에 의해 발생하는 것으로 추정되므로 주의해야하며, 저항성 균주로는 붉은느타리종, 감수성균으로 ASI 2302 균을 대조 균으로 적용하면 효과적으로 저항성 검정을 수행할 수 있을 것으로 판단된다.

느타리버섯 푸른곰팡이병에 대한 품종 저항성은 포장에서 효과적인 검토가 불가능하여 한천 배지상에서 푸른곰팡이균이 균을 저해하는 특징 fungistatic, lysis, toxin enzyme 등에 대한 각각의 특성을 실내에 검정할 수있는 방법을 검토하기 위하여 균사생장과 특이 현상을 조사하였다. 대치배양에서는 느타리버섯 균주에 따라 대치선 형성위치, 푸른곰팡이균의 느타리균사 생장부분 위로 생장(overgrowth), 대치선 이후의 버섯균의 용균(lysis)현상이 발생하여 효과적인 저항성 검정이 가능하였다. 배양여액을 여지에 적용하는 방법은 버섯균과 병원균의 종류에 따른 균사생장 및 특이적 현상이 타나나지 않았으나, well plate를 이용한 배양여액 희석방법으로 균사생장의 억제정도의 확인이 가능하였다. 분활 petri dish를 활용하여 동시배양의 경우 약간의 버섯균이 억제되는 현상은 보였으나, 푸른곰팡이균이 버섯균 생장 부분 위로 덮어 효과검정이 불가능하였다. 버섯균을 petri dish 전체에 배양한 후 그 위에 병원균의 균총을 접종하는 방법은 overgrowth, lysis등의 현상이 발생하여 병원성의 검정이 용이하였다. 실내에서의 느타리버섯균의 푸른곰팡이병에 대한 저항성 검정은 대치배양, 배양여액법, 생장후 접종법에 의한 방법으로 가능한 것으로 판단되었다.

본 연구는 국내산 침엽수로부터 천연 항균화합물 개발을 목표로 미송 및 편백으로부터 추출물을 확보 하여 푸른곰팡이병의 원인균인 Trichoderma spp. 5종을 대상으로 항균활성을 테스트하고 GC/MS를 이 용하여 항균화합물을 탐색하였다. 미송 추출물은 Trichoderma spp.에 대해 1,000 ppm에서 저해 활성을 나타냈으며, 4,000 pp에서는 T. viride>T. harzianum>T. aggressivum 순으로 70.1, 67.3, 64.7% 의 높은 항균활성을 나타냈다. 편백 추출물도 1,000 ppm에서 항균활성을 나타냈고 4,000 ppm에서 T. viride>T. harzianum>T. aggressivum 순으로 63.2, 59.3, 59.1%의 높은 항균활성을 나타냈다. 그러나 1,000 ppm의 미송추출물과 1,000 ppm의 편백추출물을 각각 9:1, 8:2, 6:4, 2:8 (w/w) 비율의 혼합제 제로 만들어 Trichoderma spp.에 처리하였을 때 미송추출물 1,000 ppm 및 편백추출물 1,000 ppm 각 각의 단일추출물보다 낮은 항균활성을 나타냈다. Trichoderma spp. 5종에 대해 높은 항균활성을 나타 내는 미송추출물에서는 2-Isopropoxy-ethylamine 46.5%, epifluorohydrin 8.6%, trans-2,3-Dimethyloxirane 7.6%, (IR)-(-)-Myrtenal 6.0%, 2-Methoxy-4-Vinylphenol 3.9%, benzaldehyde 2.8%가 함유되어 있었고, 편백추출물에서는 α-Terpinenyl acetate 14.9%, Sabinene 10.9%, dl-Limonene 9.6%, α-Terpinolene 7.5%, α-Pinene 7.1%가 함유된 것이 확인되었다.

Trichoderma spp.는 white biotechnology에서 이용되는 대표적인 미생물로서 이들이 강력하게 분비 생산하는 효소들은 산업적으로 매우 중요하다. 본 연구에서는 amylase, pectinase, cellobiohydrolase 및 xylanase 분비활성이 높은 것으로 밝혀진 Trichoderma sp. KACC 40541균주에 대한 Agrobacterium이용 형질전환을 수행하였으며 균주개량을 위한 효율적인 유전자도입 방법을 제시하였 다. 특히 형질전환을 위하여서는 균사체에 대한 적정 농도의 NaOH처리가 매우 효과적임을 보여주었다.