동물의 장기를 인간에게 이식하게 되면 초급성거부반응(Hyperacute rejection, HAR)이 일 어난다. 초급성거부반응은 면역계의 구성요소 중 보체(complement)에 의해 일어나는 거부 반응으로 돼지의 혈관세포 표면에 있는 Galα(1,3)Gal 당분자에 인간의 항체가 즉각 반응하 기 때문에 일어나며, α1,3-galactosyltransferase(α1,3-GT) 유전자는 돼지 혈관세포 표면의 Galα(1,3)Gal 당분자 생성에 관여한다. 따라서 인간에게 돼지의 장기를 이식하기 위해서는 α1,3-galactosyltransferase 유전자를 제거하는 것이 필요한 것으로 알려져 있다. 본 연구 실 의 이전 연구에서, 시카고 미니돼지 귀체세포에서 상동 재조합(Homologous recombination) 을 통해 α1,3-galactosyltransferase 유전자가 제거된 체세포를 개발한 바 있으며, 이 체세 포 를 통하여 α1,3-GT 유전자가 제거된 돼지도 생산된 바 있다. 본 연구에서는, Human serum 처리 시 돼지 세포를 보호해준다고 보고되고 있는 human complement regulator인 human Decay-accelerating factor(hDAF)와 human α1,2-fucosyltransferase(hHT) 유전자를 α1,3 -GT 유전자 위치에 gene targeting하여 동시에 hDAF와 hHT가 발현하는 체세포를 개발하였다. Knock-in vector는 hDAF와 hHT 두 유전자가 발현할 수 있도록 IRES로 연결하였으며 α 1,3-GT 유전자의 start codon을 이용하여 발현할 수 있도록 구축하였다. 구축한 vector는 electroporation을 통해 미니돼지 체세포에 도입하였으며, PCR 결과 α1,3-GT 유전자 위치 에 서 상동 재조합이 일어났음을 확인하였다. Positive-negative 선별 방법을 통해 얻은 gene targeting된 체세포는 RT-PCR에 의해 hDAF와 hHT 유전자의 발현이 확인되었으며, 대조군 (NIH minipig)에 비해 α1,3-GT 유전자의 발현이 감소하였다. 또한, 이들 세포에 100% human complement serum을 처리하였을 때 Knock-in 세포가 대조군에 비해 30% 정도 더 높 은 생존율을 보였다. 따라서 개발된 체세포는 이종간 장기이식을 위한 돼지 생산과 함께 이를 이용한 이종간의 장기 이식 시 초급성 거부반응을 억제하는 데 사용 될 수 있을 것으로 생각된다.

현재 널리 사용되고 있는 목적 유전자 발현 조절 시스템은 Gossen과 Bujard에 의해 개발 된 tetracycline-inducible gene expression system (Tet system)으로서, 유도체인 tetracycline 계열의 물질의 공급 여부에 따라 외래 유전자의 발현을 가역적이며 유도적으로 조절할 수 있다. 이 시스템은 중금속이나 steroid hormone 등을 이용한 발현 조절 시스템에 비해 발 현 유도율이 높고 비특이적인 발현이 상대적으로 낮으며, 유도물질에 의한 세포 독성이나 다 면 적 영향이 거의 나타나지 않는 장점을 가진다. 그러나 비유도 조건에서 완벽한 발현 억제가 이루어 지지 않은 관계로 background 활성이 미미하게 존재하고 있어서 이를 해결하기 위 한 연구가 진행되고 있으며 유도물질에 대한 transactivator의 감수성을 향상시켜서 낮은 유 도체의 농도에서도 유전자의 발현을 극대화하기 위한 시도도 이루어지고 있다. 본 연구에서는 가장 개선된 형태의 Tet system의 각 요소들을 재조합하여 one vector 형 태의 유전자 발현 조절 시스템을 구축한 후, 일차배양한 세포주에서 이 시스템의 효율성을 증명하고자 하였다. 재조합한 요소는 유전자 발현 조절을 위한 Tet system의 구성에 있어 서 가장 중요한 2가지 요소인 transactivator와 tetracycline response element (TRE)로 각 각 의 일부 서열이 변형된 형태이다. 도입한 transactivator는 유도 조건에서의 외래 유전자의 발현을 극대화시키고 발현 유도물질인 doxycycline에 대한 감수성을 높여서 저농도의 doxycycline 조건에서도 발현 유도가 가능하다. 또한, 변형된 TRE 서열에는 endogenous mammalian transcription factor 결합 부위가 존재하지 않으므로 transactivator가 없는 경우 유전 자의 발현이 turn on되지 않으므로 background 활성이 거의 나타나지 않는다. 실제적으로 기존의 Tet system에서는 비유도 조건에서의 외래 유전자인 GFP의 발현을 미미하게 나타 낸 데에 비해 개선된 Tet system에서는 GFP의 발현이 거의 나타나지 않았다. 또한, 유도 조건에서는 기존의 system에 비해 새롭게 구축한 system에서 강한 발현을 나타내었으며 발현 유도율도 매우 높은 것으로 확인되었다. 구축한 Tet vector system에서 WPRE 서열의 위치와 표적세포주의 종류에 따른 GFP의 발현 양상을 확인한 결과, 소의 태아섬유아세포 에서는 WPRE가 transactivator 서열의 3′ 위치에 존재한 vector에서 발현이 가장 강하게 나 타났으며 닭의 배아섬유아세포에서는 WPRE가 TRE 서열의 3′ 위치에 존재한 vector에서 강한 발현을 보였다. 본 연구에서 구축한 개선된 형태의 Tet system은 완벽한 외래 유전자의 발현 조절을 가 능하게 함으로써 세포 수준에서나 개체 수준에서의 관련 연구에 있어서 유용한 유전자 전 이 수단으로 이용될 수 있을 것이다. * 본 연구는 농촌진흥청 차세대 바이오그린21사업(과제번호: PJ007990042012)의 지원에 의해 이루어졌다.

복제동물 생산을 위한 체세포 핵이식 성공률은 공여세포 준비를 포함하여 많은 요소들에 의한 변수가 크다. 체세포 핵이식의 공여세포로 사용되는 세포는 G0/G1기로 세포주기를 맞 춘 confluence한 신선 배양세포를 일반적으로 이용하고 있다. 그러나 본 연구에서는 돼지 체세포 복제수정란 생산시 동결융해세포의 이용가능성을 확인하고자 일반세포와 형질전환 세포에서 신선한 배양세포와 동결융해세포를 이용한 복제수정란의 체외발달능력 및 배반 포 의 세포자연사를 비교하였다. 공여세포는 유전자가 삽입되지 않은 일반 미니돼지 귀세포와 상기세포에 GalT 유전자가 적중된 형질전환세포를 이용하였다. 배양세포는 confluence상태에서, 동결융해세포는 confluence 상태에서 동결된 세포를 융해하여 핵이식에 사용하였다. 수핵란과 공여세포가 융합 된 복제수정란은 PZM-3 배양액에서 38.5℃, 5% CO2, 5% O2 조건하에서 6일간 배양하여 배반포 발달율을 조사하였으며, 배반포의 세포자연사는 TUNEL법을 이용하여 분석하였다. 일반세포의 경우, 융합율(83.3 vs 79.1%), 배반포 발달율(18.0 vs 15.0%), 배반포 세포수 (38.4±12.8 vs 42.0±12.4) 그리고 배반포의 세포자연사 비율(2.1±2.7 vs 1.9±3.7%)은 배 양 세포와 동결융해세포 간에 차이가 없는 것으로 나타났다. 형질전환세포의 경우, 융합율 (87.0 vs 82.4%), 배반포 발달율(24.6 vs 17.3%) 그리고 배반포 세포수(35.3±11.9 vs 37.7± 15.4)는 두 세포군 간에 통계적 차이가 없는 것으로 나타났지만, 배반포의 세포자연사 비율 (6.0±4.8 vs 10.6±9.4%)은 배양세포가 동결융해세포보다 유의하게 낮은 것으로 나타났다 (p<0.05). 본 연구 결과는 배양된 신선 체세포를 대체하여 confluence 상태에서 동결보존된 돼지 체 세포는 융해 직후 공여세포로서 돼지 복제수정란 생산에 유용하게 활용될 수 있음을 제시 하고 있다.

돼지는 인간과 생리적으로 유사하기 때문에 다양한 목적으로 연구되고 있다. 최근에는 돼 지를 이용한 이종장기이식 관련 연구가 큰 주목 받고 있으며, 치료용 단백질을 생산하기 위 한 생체반응기로써 이용되고 있다. 이러한 연구에 있어서 당 사슬의 역할은 매우 중요하다. 당 사슬은 치료용 단백질의 체내 안정성에 큰 영향을 미치며 다양한 방법으로 면역을 조절 한다고 알려져 있다. 하지만 돼지에서의 당 사슬 관련 연구는 미비하며, 많은 당 전이효소 들의 서열이나 기능이 정확히 분석되지 않고 있다. 따라서 이번 연구에서는 당 전이효소 중 하나인 β‐1,3‐N‐acetylglucosaminyltransferase 1 (B3GNT1)을 돼지로부터 동정 후 PK‐15 세 포주를 이용하여 기능분석을 하였다. 이 유전자는 다양한 glycan epitope를 형성하는데 있 어서 중요한 기능을 한다. 먼저 간 조직으로부터 획득된 cDNA를 주형으로 degenerated PCR을 수행하여 유전자를 동정하였다. 동정된 유전자는 368개의 아미노산을 encoding하 는 1227개의 nucleotide로 구성되어 있으며, 다른 종에서 보고된 B3GNT1과 높은 상동성을 가 지고 있는 것을 확인하였다. 또한, 기능 분석을 위하여 돼지 신장세포인 PK‐15에서 B3- GNT1의 과 발현을 유도하였다. RT‐PCR과 Western blot을 통하여 유전자의 과발현을 확인 하고, Lycopersicon esculentum lectin (LEA)를 이용한 ELISA 분석 방법을 통해 효소의 기 능을 확인하였다. B3GNT1은 poly N‐acetylactosamine (polyLacNAc) 형성에 중요한 역할 을 하기 때문에 이를 특이적으로 인지하는 LEA를 사용하였다. 이를 통해 B3GNT1의 과발현이 유도된 세포에서 더 많은 polyLacNAc이 합성되었음을 확인할 수 있었다. 또한, Gal(β1‐ 3)GalNAc structure를 이용한 기질반응을 통해 효소의 기능을 확인하였다. 과발현이 유도 된 세포에서 약 3배 이상의 높은 기질 반응성을 보였으며, 이를 통해 돼지로부터 클로닝 된 B3GNT1의 기능을 확인할 수 있었다. 돼지로부터 당 전이효소를 동정하고 분석하는 연구는 생체반응기로써 돼지를 이용하는 다른 연구에 중요한 기반이 될 것이라고 생각한다

유즙 내에 들어있는 유용 단백질을 분리, 정제하였을 때 예상되는 경제적 가치 때문에 우 리는 유즙 내에 들어있는 재조합 hEPO 단백질을 추출하고 정제하려는 많은 시도를 하고 있다. 이러한 노력에도 불구하고 유즙 내에 들어있는 target 단백질의 정제가 매우 어렵고, 그 순도 역시 20%에 지나지 않는다. 우리는 hEPO 유전자를 가지고 있으며 유선에서 hEPO를 분비하는 형질전환 돼지를 생산 보유하고 있다. 그러나, 이들 형질전환 돼지들은 체내에 도입된 유전자의 발현에 의해 야기되는 적혈구 과다증 그리고 혈소판 감소증과 같 은 순환기의 문제가 유발되고 있다. 명백하게, 이러한 종류의 혈액학적 변화는 장기의 정상 적인 기능을 방해하며 형질전환 돼지의 갑작스런 죽음을 초래한다. 그러므로, 앞서 언급한 문제점들을 해결하기 위한 alternative한 방법이 필요하다. 현재 연구에서, 우리는 외인성 hEPO를 발현하는 돼지에서 비정상의 생리학적 증후에 관해서 실험하였으며 hEPO를 생산 하기 위한 alternative choice로서 형질전환 돼지 유래 세포의 배양 system을 제안하였다. 5마리의 F6 hEPO 형질전환 돼지와 4마리와 대조군으로 일반돼지(랜드레이스)를 국립축 산과학원 동물바이오공학과에서 사육 도축하고 순환 장기를 채취하였다. 형질전환 돼지 순 환기 조직(유선, 신장, 폐, 비장)을 계대 배양 후 hEPO mRNA의 발현을 RT-PCR 방법으로 분석하였다. 또한, 면역조직화학 염색법을 통해서 hEPO 형질전환돼지 순환 장기조직에서 발현되는 hEPO의 발현 양상을 분석한 결과로서 유선, 신장 및 폐 조직에서 hEPO의 발현 이 확인되었으나, hEPO 발현 양상이 모든 형질전환동물 조직에서 발현되는 경향을 보이지 는 않았다. 한편, 세포면역화학 분석법에서는 형질전환돼지 유래 세포의 배양 시 hEPO가 발현되고 있는 양상을 확인하였다. 또한, 형질전환 돼지와 일반돼지의 세포 증식률과 증식 속도는 신장 세포에서는 빠른 증식을 나타낸 반면, 폐와 비장 세포에서는 느린 증식률이 확 인되었다. 배양 후 지속적인 세포 증식과 세포의 생존성을 분석하기 위하여 Apoptosis를 TUNEL과 Annexin V를 이용한 방법으로 조사한 결과, 형질전환돼지 유래의 세포와 일반돼 지의 세포 사이에 유의적 차이는 발견하지 못했다. 이들의 결과들로서 본 연구에서는 형질 전환돼지를 생산하여 유용 단백질을 이용하고자 할 경우, 목적으로 하는 세포 뿐 만 아니라 형질전환가축 유래의 다양한 세포를 이용 할 수 있는 가능성을 시사하고 있다.

체세포 핵이식은 형질전환 복제 동물 생산과 더불어 그에 따른 바이오 신약의 개발, 장기 생산 등 많은 장점이 있지만, 여전히 체세포 핵이식 동물의 생산성은 임신율이 낮고 비정상 적인 개체의 탄생 등의 문제점이 있다. 그 이유 중 하나로 핵이식에 사용되는 공여세포가 다시 수정란으로 돌아가는 과정에서 후생학적 역분화가 불완전하게 이루어지기 때문이다. 본 연구는 체세포가 유도만능 줄기세포로 역분화하는 과정에서 사용되는 리프로그래밍 전 사인자 (Oct4, Klf4, Sox2와 c-Myc, OKS-M)의 도입과 더불어, 후생학적 변형에 관련된 억 제제 trichostatin A(TSA), 5-aza-20-deoxycytidine(5-aza), GSK-3 inhibitor와 MEK inhibitor (2i)가 복제 수정란에 미치는 영향에 대해서 연구하였다. 젖소 귀 세포에 전사인자 Oct4, Klf4, Sox2와 c-Myc을 도입하였고, 배양 시간이 흐름에 따라 세포크기가 작아짐 (11.72± 3.39, 8.42±4.95, p<0.05)을 볼 수 있었으며, RT-PCR을 통하여 8개의 콜로니 중 4개의 콜 로니에서 외인성 유전자를 발견하였다. 리프로그래밍에 관련된 내인성 유전자의 활성을 증 가시키기 위하여 HDAC 억제제인 trichostatin A (20 nM), DNA methyltransferase 억제제인 5-aza-20-deoxycytidine (10 μM), 줄기세포 분화 경로 억제제인 GSK-3 (3 μM) and MEK (1 μM)를 처리하였다. 4개 중 1개의 콜로니에서 내인성 유전자의 활성이 증가됨을 발견하였 다. H3K9/K14의 acetylation 상태는 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나 체세포 핵이식의 분 할률에서는 somatic cells이 85.9±8.98%, OKS-M 처리군이 82.0±4.97%, OKS-M을 도입한 체세포에 TSA, 5-aza, 2i 처리군이 각각 88.4±7.89, 75.3±8.10, 74.2±2.90%로 OKS-M과 TSA를 함께 처리하였을 때 가장 높은 분할률을 보였고, 배반포와 상실배기 까지의 발달률 은 somatic cells이 9.6±3.79%, OKS-M 처리군이 12.6±6.54%, OKS-M을 도입한 체세포에 TSA, 5-aza, 2i를 처리하였을 때 각각 11.1±6.87, 20.1±5.89, 9.5±1.53%로 OKS-M과 5- aza 를 함께 처리하였을 때 유의적으로(p<0.05) 가장 높은 발달률을 보였다. 따라서 전사인자의 도입과 후생학적 변형과 관련된 억제제의 처리는 소 복제 수정란의 발달률 향상에 영향을 주는 것으로 나타남에 따라, 앞으로 다양한 억제제와 처리조건에 따 라 복제수정란의 향상을 위한 최적화된 방법을 유도할 필요가 있다.

Tumor cells, especially in a malignant form, proliferate rapidly that blood supply within the tumors becomes limited, leading to a condition of insufficient oxygen supply. Such hypoxic condition is known to impair the viability of cancer cells, but it can also be a factor to facilitate the appearance of cells with a higher degree of malignancy. Indeed, the hypoxic condition created within malignant tumors may contribute to promoting their aggressive behaviors, including tumor invasion and metastasis, and to the development of resistance to various therapeutic modalities such as chemotherapy. Recently, microRNAs, a group of short RNA fragments consisting of 18 to 20 nucleotides, have been shown to participate in regulating genes important for cell survival, differentiation and apoptosis. Since their discovery, modulation of these microRNAs has been a focus of intensive studies with regard to their significance on gene regulation and various aspects of cell biology. In this study, we investigated hypoxia-induced alterations in microRNAs in oral squamous cell carcinoma (OSCC) cells and discussed consequential gene modulation and relevant cellular responses.

Ameloblastomas are benign odontogenic tumor and the most common neoplasm in jaws and they have locally invasive property and high recurrence rate. Four typical subtypes ameloblastomas are plexiform, follicular, granular cell and acanthomatous type, but their developmental states during tumorigenesis are uncertain. And thus authors studied about developing states of four types of ameloblastomas by immunohistochemical staining for cytokeratin 8/18 which was an intermediate filament of epithelial cell origin and for vimentin which was an intermediate filament of mesenchymal cell origin, and then by comparative analyses of the results. Authors selected seven cases for every four types of ameloblastomas, and then performed immunohistochemcial staining for cytkeratin 8/18 and vimentin to all selected specimen by using monoclonal antibodies about cytoleratin 8/18 and vimentin, LSAB(Labelled StreptoAvidin Biotin) reactant and HRP(Horse Radish Peroxidase) system. Labelling indices of cytokeratin 8/18 of plexiform and follicular types of ameloblastomas were significantly high values in the group of ameloblast-like cells and labelling indices of cytokeratin 8/18 of all types of ameloblastoma were high values in the group of transformed cells, but their differences were not significant. Labelling index of vimentin of plexiform ameloblastoma was significantly high value in the group of ameloblast-like cells and others showed comparatively lower values. Labelling index of vimentin of granular cell type of ameloblastoma in the group of transformed cells was significantly high value and others showed comparatively lower values. Consequently the most primitive form of ameloblastoma was plexiform, and more differenciated form was follicular type and granular cell type and acanthomatous type were most differenciated form of ameloblastomas

Multinucleated giant cells appear in a variety forms in different types of oral lesion. However, their nature is still not well understood. Thus, to address this issue, the immunohistochemical characteristics of inflammatory giant cells (Langhans’ giant cells in lesions of tuberculosis and foreign body giant cells in odontogenic keratocysts and squamous cell carcinomas) and tumor giant cells in central giant cell granulomas were compared with those of osteoclasts, the normal giant cell, using a panel of macrophage and osteoclast marker antibodies, such as calcitonin receptor (CT-R), c-Src, Cathepsin K (Cath-K), CD14, RANK, and c-fms. The foreign body giant cells around cholesterol clefts in inflamed odontogenic keratocysts revealed more macrophage-like characteristics than the foreign body giant cells resorbing keratin pearls in squamous cell carcinomas. As such, both cases of foreign body giant cell exhibited immunoreactivity for the macrophage markers, such as CD14, RANK, and c-fms, yet only the latter case exhibited immunoreactivity for the osteoclast markers, such as CT-R and c-Src. Moreover, both cases of foreign body giant cells were positive for TRAP activity, yet negative for Cathepsin K activity. In contrast, the other inflammatory giant cells, Langhans’ giant cells, exhibited immunoreactivity for both the macrophage and osteoclast markers, yet were negative for TRAP activity. Meanwhile, the giant cells in the central giant cell granulomas reacted positively to both the macrophage and osteoclast markers, and were also positive for TRAP activity. Accordingly, these findings suggest that the immunoprofiles of giant cells in oral lesions vary according to the nature of the lesion, despite shared osteoclast and macrophage characteristics. Furthermore, the giant cells in tumorous lesions closely associated with bony destruction revealed more osteoclastic characteristics and their enzyme components were different according to the nature of the lesion

Oral squamous cell papillomas(OSCPs) showed various features in their etiology, histology, and prognosis. Therefore, it is necessary to diagnose differentially according to their pathological examinations. In the present study total 14 cases of OSCPs were evaluated and characterized to be three types of OSCPs, i.e., papillary papilloma, verrucous papilloma, and inverted papilloma. The present study demonstrated that among 14 cases of OSCPs papillary papilloma (n＝6) showed the typical papillary projection of squamous epithelium with severe acanthosis of upper spinous layer cells, accompanying frequent nuclear vacuolization. And verrucous papilloma (n＝7) showed the diffuse acanthosis of whole spinous layer cells with severe basal hyperplasia, resulted in the thick squamous epithelium exhibiting verrucous surface and irregularly ingrowing rete pegs. One case of inverted papilloma showed the typical ingrowth of basal layer cells deeply into underlying connective tissue, resulted in the formation of multiple fissures on the surface area. The present study also revealed the predominant nuclear vacuolization suspicious for viral infection in papillary papilloma, and also heavy smoking history in the verrucous papilloma. On the other hand, as the epithelium of inverted papilloma ingrew into the underlying deep connective tissue up to the muscular layer, it is supposed that the inverted papilloma has a potential of basal layer proliferation strong enough to invade the protecting barrier of underlying connective tissue, or that the underlying connective tissue was too weak to prevent the ingrowth of basal layer epithelium. Taken together, because the OSCPs show heterogenous origins and variable pathological prognosis, it is suggested that the OSCPs should be differentially diagnosed at least into three types, i.e., papillary papilloma, verrucous papilloma, and inverted papilloma.

In this article, we proposed a novel technique to fabricate cell‐culturing scaffold, that is, the hollowcylinder‐ grain assembly technique. This technique uses hollow cylindrical particles with sub‐mm thickness. Firstly, we fabricate PCL (polycaprolactone) hollow cylinder with sub-mm thickness using lab-made stainless steel mold. After that, we put the above-mentioned fabricated particles into a metal mold of which temperature could be controlled with hot plate and heat insulation system. PCL particles in the metal mold could be assembled together without severe collapsing under adequate temperature and time. Consequently, we could fabricate scaffold or foam structure with interconnected‐porosity and observed surface of cross section of fabricated scaffold by SEM.

The objective of the present study was to evaluate the potential antidiabetic and antioxidant effect of the ethanol extract from Chrysanthemum cornarium L. var. spatiosum(CSE) against alloxan-induced oxidative stress in pancreatic β-cells, HIT-T15. In this study, the antidiabetic effect of CSE was examined using the 3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazoliu bromide(MTT) cell proliferation assay, lactate dehydrogenase(LDH) release assay, NAD+/NADH ratio and insulin secretion. To further investigate whether CSE is involved in the antioxidant activity of alloxan-damaged HIT-T15 cells, its antioxidant effect against alloxan-induced oxidative stress was measured in HIT-T15 cells by determining the levels of antioxidant enzymes including superoxide dismutase(SOD), glutathione S-transferase(GST), glutathione reductase(GR) and glutathione peroxidase(GPx). The results of this analysis showed that alloxan significantly decreased cell viability, increased LDH leakage, and lowered NAD+/NADH ratio and insulin secretion in HIT-T15 cells. However, CSE significantly increased the viability of alloxan-treated cells and lowered LDH leakage. The intracellular NAD+/NADH ratio and insulin secretion were also significantly increased by 1.7-fold and 1.3-fold, respectively, after treatment with 100 ㎍/㎖ CSE. The HIT-T15 cells treated with alloxan showed significant decreases in the activities of antioxidant enzymes, while CSE significantly elevated the levels of antioxidant enzymes. These findings suggest that CSE could have a protective effect against cytotoxicity and dysfunction of pancreatic cells in the presence of alloxan-induced oxidative stress.

Catharanthus roseus로부터 생산되는 빈카알칼로이드는 암을 치료하는 데에 사용되는 가장 중요한 천연물 중의 하나이다. 이러한 항암제는 두 단량체 인돌 알칼로이드인 catharanthine과 vindoline의 결합으로 합성될 수 있다. 이 중 vindoline의 생합성에 관계하는 경로를 조사하기 위해서 tabersonine의 메틸기에 중수소를 치환한 전구체인 tabersonine-CD3 1a를 합성하였다. 이는 중수소의 질량 증가로 인해 자연에서 발생하는 tabersonine과 뚜렷이 구별될 수 있도록 해 준다. 우리는 이 중소소가 치환된 tabersonine 1a가 성공적으로 vindoline 생합성경로에 편입되어 중수소가 치환된 3개의 새로운 vindoline 중간체(2a, 3a와 4a)를 생성함을 보였다. 세포현탁배양액에 tabersonine-CD3 1a를 주입한 5일과 13일째에 생성된 대사물인 16-Hydroxytabersonine-CD3 (m/z 356) 2a, 16-Methoxytabersonine-CD3 (m/z 370) 3a와 16-Methoxy-2,3-dihydro-3- hydroxytabersonine-CD3 (m/z 388) 4a의 생성량을 UPLC/MS를 사용하여 측정하였다. 출발물 1a에서 생성물 2a, 그리고 2a에서 3a로의 전환은 빨랐던 반면 3a에서 4a로의 전환은 상대적으로 훨씬 느렸다. 따라서 각 대사물들의 상대적 전환속도를 서로 비교해 보았을 때 vindoline 생합성 과정의 첫 세 단계 중에서 가장 느린 마지막 단계가 속도결정단계임을 암시한다. 즉 대사물 3a에서 4a로의 느린 전환속도의 결과, 배양 후 13일까지도 3a의 축적률이 현저히 증가됨을 보였다. 배양 5일째의 대사물 2a, 3a와 4a의 축적비는 각각 1, 2와 0.1이었다. 그러나 desacetoxyvindoline-CD3 5a, deacetylvindoline-CD3 6a와 vindoline-CD3 7a의 피크는 배양 13일 후에도 발견되지 않아 세포현탁 배양액에 각 생합성단계와 관련된 효소들이 존재하지 않음을 알 수 있었다.

For reconstituting genetic resource(Korean Native Chicken: KNC) with grem-line chimeric chicken made with cryopreserved biastdermal cells, the experiments were carried out to optimize cryopreservating conditions. Stage X biastdemal cells were collected from KNC embryos and dissociated. Cells were susupended in medium containing cyopretectant and fetal bovine serum(FBS), and distributed into plastic ampules. Cell susupensions were seeded to induce ice formation at —7 ℃ to —35 ℃ at in the experiments, the effect of modification of dissociation way, concentration of FBS and cell density on the vaibility of frezen-thawed cells were investigated by trypan blue exclusion. Then change the way of cell dissociation from pipetting to short time vortexing, viability of frozen-thawed cell tended to be increaced from 29 % to 52 %. Increase concentraition of FBS in frozen medium from 20 % to 80 % made viability of thawed cell from 28 % to 35 %. The viability of thawed cells were 33.9% frozen at 2 embryos/ 0.5ml, and 43.6 % frozen at 20 embryos/0.5 ml. Furthermore, combination of three modifications make big improvement. The viability of frozen-thawed cell was 60 % for combinated method, and 41 % for general method. This result means the advance to practical cryoreservation of blastdermal cell of the KNC(Ogolgye breed).

It has been suggested that Helicobacter pylori(H. pylori) infections can promote the development and progression of gastric cancer through the modulation of cell cycle regulators such as p27Kip1 and Skp2. p27Kip1 is a cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor that blocks the G1/S transition necessary for cell cycle progression. Skp2 is a component of the ubiquitin ligase complex called SCFSkp2(SKP1-Cullin-F-box), which specifically binds and promotes the degradation of p27Kip1. A low level of p27Kip1 and a high level of Skp2 have been reported in many types of cancers, including gastric cancer. In addition, a decrease in p27Kip1 has been reported in H. pylori-infected specimens. However, data on Skp2 in H. pylori infections are limited. This study examines the changes in the status of Skp2 in H. pylori-infected gastric epithelial AGS cells. For this, we stimulated AGS cells with H. pylori(NCTC 11637) at the ratio of 300:1(bacterium:cell) for 6 hours. The results of an immunoprecipitation analysis, followed by a western blot, indicate that the interaction between Skp2 and 14-3-3 was elevated 3 hours after the H. pylori treatment. In addition, there was an increase in cytoplasmic Skp2 after 3 hours, whereas there was no change in the nuclear level. Since it has been reported that interaction with 14-3-3 and the subsequent cytoplasmic translocation of Skp2 can increase its protein stability, increases in the interaction with 14-3-3 and the cytoplasmic Skp2 after the H. pylori treatment can increase the level of Skp2 in AGS cells. This phenomenon may explain, at least to some extent, the mechanism underlying the relationship between H. pylori infections and gastric carcinogenesis.

DNA methyltransferase 1 (Dnmt1) gene contains three different isoform transcripts, Dnmt1s, Dnmt1o, and Dnmt1p, are produced by alternative usage of multiple first exons. Dnmt1o is specific to oocytes and preimplantation embryos, whereas Dnmt1s is expressed in somatic cells. Here we determined that porcine Dnmt1o gene had differentially methylated regions (DMRs) in 5’-flanking region, while those were not found in the Dnmt1s promoter region. The methylation patterns of the porcine Dnmt1o/Dnmt1s DMRs were investigated using bisulfite sequencing and pyrosequencing analysis through all preimplantation stages from one cell to blastocyst stage in in vivo or somatic cell nuclear transfer (SCNT). The Dnmt1o DMRs contained 8 CpG sites, which located in —640 bp to —30 bp upstream region from transcription start site of the Dnmt1o gene. The methylation status of 5 CpGs within the Dnmt1o DMRs were distinctively different at each stage from one-cell to blastocyst stage in the in vivo or SCNT, respectively. 55.62% methylation degree of the Dnmt1o DMRs in the in vivo was increased up to 84.38% in the SCNT embryo, moreover, de novo methylation and demethylation occurred during development of porcine embryos from the one-cell stage to the blastocyst stage. However, the DNA methylation states at CpG sites in the Dnmt1s promoter regions were hypomethylated, and dramatically not changed through one-cell to blastocyst stage in the in vivo or SCNT embryos. In the present study, we demonstrated that the DMRs in the promoter region of the porcine Dnmt1o was well conserved, contributing to establishment and maintenance of genome-wide patterns of DNA methylation in early embryonic development.

To understand growth characteristics of eight dominant red tide species (Prorocentrum minimum, Heterocapsa triquetra, Scrippsiella trochoidea, Akashiwo sanguinea, Chattonella marina, Heterosigma akashiwo, Amphidinium carterae and Rhodomonas salina) in the Korean coastal water, the growth rates were examined in relation with the impacts of water temperature and bio-volume. Of these, P. minimum, C. marina, H. akashiwo, A. carterae and R. salina were eurythermal species with relatively high growth rates in a borad ranges (15 to 25􀆆C) of water temperature. On the other hand, the growth rate of H. triquetra, S. trochoidea and A. sanguinea were high in relatively mid temperature (optimum: 25􀆆C) condition. In particular, H. triquetra was well adapted in low temperature of 5 to 15􀆆C, implying that the species can survive and grows even at very low temperature. Based on results of our experiment, the growth characterestics of five eurythermal species and three mid temperature species may have dominated in Korean coastal water during summer season and fall season, respectively. Contrastively, the growth characteristics of H. triquetra make a consistently dominant during the cold winter season. In addition, the growth rates of large bio- volume species were lower than those of small bio-volume species, indicates that growth of single cells of several flagellates might be depended on the cells sizes.

Ti-Ni alloys are widely used in numerous biomedical applications (e.g., orthodontics, cardiovascular science, orthopaedics) due to their distinctive thermomechanical and mechanical properties, such as the shape memory effect, superelasticity and low elastic modulus. In order to increase the biocompatibility of Ti-Ni alloys, many surface modification techniques, such as the sol-gel technique, plasma immersion ion implantation (PIII), laser surface melting, plasma spraying, and chemical vapor deposition, have been employed. In this study, a Ti-49.5Ni (at%) alloy was electrochemically etched in 1M H2SO4+ X (1.5, 2.0, 2.5) wt% HF electrolytes to modify the surface morphology. The morphology, element distribution, crystal structure, roughness and energy of the surface were investigated by scanning electron microscopy (SEM), energy-dispersive Xray spectrometry (EDS), X-ray diffractometry (XRD), atomic force microscopy (AFM) and contact angle analysis. Micro-sized pores were formed on the Ti-49.5Ni (at%) alloy surface by electrochemical etching with 1M H2SO4+ X (1.5, 2.0, 2.5) wt% HF. The volume fractions of the pores were increased by increasing the concentration of the HF electrolytes. Depending on the HF concentration, different pore sizes, heights, surface roughness levels, and surface energy levels were obtained. To investigate the osteoblast adhesion of the electrochemically etched Ti-49.5Ni (at%) alloy, a MTT test was performed. The degree of osteoblast adhesion was increased at a high concentration of HF-treated surface structures.

Metastasis consists of complex cascades and a lot of factors are involved in each step of metastasis. In recent studies, the role of epithelial-mesenchymal transition (EMT) in metastasis is suggested. EMT has a feature of epithelial cells conversing into mesenchymal cells morphologically and phenotypically, is a characteristic of malignant and metastatic cells in most cancer. The mesenchymal cells usually show more malignant phenotype, including invasion and metastasis. EMT can play an important role in metastasis of oral squamous cell carcinoma (OSCC). Although the role of Snail, slug, other transcriptional factors and E-cadherin are well known in human cancers, there are a few studies on N-cadherin and Twist expression in OSCC. The present study was aimed to analyze the expression of N-cadherin and Twist protein in OSCC from Korean patients. The immunohistochemical stain was performed using 58 primary OSCCs and 6 metastatic OSCCs, and the correlation between the expression of these proteins and clinicopathological parameters of OSCC patients was analyzed. The expression rate of high expression of N-cadherin was observed in 70.4% and Twist in 87.3% of OSCC. The expression of N-cadherin in metastatic OSCC increased than in corresponding primary OSCC (p<0.05). The spearman correlation coefficiency between N-cadherin and Twist was calculated as 0.228. The clinical factors such as lymph node metastasis and survival showed statistically significant correlation between N-cadherin expression. The expression of Twist was correlated with recurrence. In conclusion, the authors suggest that N-cadherin may play an important role in malignant behaviour of OSCC and can be considered as prognostic indicator of OSCC.