Background : Alzheimer`s disease (AD) is characterized by neuronal loss and extracellular senile plaque, whose major constituent is β-amyloid (Aβ), a 39-43 amino acid peptide derived from amyloid precursor protein. In cultures, Aβ can directly induce neuronal cell death and can render neurons vulnerable to excitotoxicity which may involve glutamate release and N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Silybum marianum (SM) has been used for centuries to treat liver disease due to its antioxidant, and anti-inflammatory properties. In particular, Silymarin, an active constituent of SM, has been reported to decrease lipid peroxidation. Therefore we hypothesized that SM might protect neurons against neurodegeneration in AD due to its antioxidant and anti-inflammatory activities. In the present study, the protective effect of ethanol extract from the stem of SM on Aβ (25-35)-induced neuronal cell death was examined in primary cultured rat cortical neurons. Methods and Results : Primary cultured cortical neurons were prepared using embryonic day 15 SD rat fetuses. Neurotoxicity experiments were performed on cultured neurons after 4-5 days in vitro. The cells were treated with 10 μM Aβ (25-35) or 1 mM NMDA for 36 h or 14 h, respectively. SM was applied 15 min before treatment of Aβ (25-35) or NMDA and also present in the medium during the incubations. The viability of neurons was monitored using a colorimetric MTT assay and Hoechst 33342 staining. The expression levels of anti-apoptotic and pro-apoptotic proteins were detected by western blot. An Ethanol extract of the stem of SM (10 and 50 μg/ml) significantly prevented Aβ (25-35)-induced apoptotic neuronal cell death in cultured cortical neurons. Furthermore SM inhibited Aβ (25-35)-induced decrease of anti-apoptotic protein, Bcl-2, and increase of pro-apoptotic proteins, Bax and active caspase-2, in western blot analysis. SM (10 and 50 μg/ml) also reduced NMDA-induced neuronal cell death. These results suggest that NMDA glutamate receptor activation is implicated in Aβ (25-35) -induced neuronal apoptotic death. Conclusion : The present study suggests that SM has a possible therapeutic role for preventing the progression of neurodegenerative disease such as Alzheimer's disease.

Background : Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disease characterized by progressive memory loss, cognitive impairment and personality defects accompanied by diffuse structural abnormalities in the brain. The major pathological hallmarks of AD include beta amyloid (Aß) protein deposition, presence of neurofibrillary tangles and neurodegeneration of cholinergic neurons. Aß, a 39-43 amino acid proteolytic fragment of amyloid precursor protein, is the major constituent of the senile plaques. Rice bran, the major byproduct of the rice milling industry, is the source of a high quality vegetable oil. Rice bran oil (RBO) has attracted much medicinal attention for its strong hypocholesterolemic properties because of its balanced fatty acid composition and high levels of antioxidant phytochemicals such as oryzanols, tocopherols and tocotrienols. The present study aims to investigate the protective effect of RBO against Aß (25-35)-induced neurotoxicity in in vitro and in vivo. Methods and Results : Memory impairment was produced by intracerebroventricular (i.c.v) microinjection of 15 nmol Aß (25-35) and measured by passive avoidance test in ICR mice. Glutathione concentration, lipid peroxidation rate and acetylcholine esterase activity were measured in mice brain. The expression levels of phosphorylated mitogen activated proteins kinases (MAPKs), inflammatory factors, and anti-apoptotic and pro-apoptotic proteins in mice brains were detected by Western blot. Cerebral cortical neuronal cells were cultured from 15-days-old fetus. Cortical neurons were incubated with 10 μM Aß (25-35) for 36 h. Cell viability was measured by MTT assay. Chronic treatments of RBO (0.1-1 ml/kg, 8 days, p.o.) protected against memory impairment induced by Aß (25-35). Depletion of glutathione level, lipid peroxidation and increased acetylcholine esterase activity by the treatment with Aß (25-35) were inhibited by administration of RBO. The increase of phosphorylated MAPKs, inflammatory factors, and proapoptotic proteins and the decrease of antiapoptotic protein in Aß (25-35)-administered mice brain were significantly inhibited by treatment with RBO. RBO (0.1-5ul/ml) inhibited 10μM Aß (25-35)-induced neuronal cell death in cultured cortical neurons. Conclusion : The present study suggests the role of RBO as a promising therapeutic for neurodegenerative diseases like AD and stroke.

Background : Ginsenosides, the main ingredient of ginseng roots can be confirmed various physiological activity such as anticancer, antioxidant, a natural ginsenosides is there a structure to be absorbed into the body does not work well absorbed through this process biologically active thus a high conversion ginsenosides. β-glucosidase enzyme is observed in several of the microorganism with an enzyme that serves to convert a ginsenoside prosper that is absorbed into the body. Methods and Results : To view a primary β-glucosidase activity, the bacteria were innoculated in esculin agar medium and the color change of the media were measured by the time and degree of changing color. In the other method, 5 mM of p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG) containing 25 mM phosphate buffer solution (pH 7.0) was added to 50 ul enzyme solution. Then the solution was added to 50 ul reaction for 5 min at 30°C. The amount of p-nitrophenol liberated measured at 405 nm absorbance. The experimental results showed higher β-glucosidase activity in Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc mesenteroide, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, and Paenibacillus polymyxa by using esculin agar medium method. Similarly in second method, β-glucosidase activity was higher in P. pentosaceus 402.32±11.43 unit/l, L. mesenteroide 353.73±14.64 unit/l, Lactobacillus sakei 198.4±15.47 unit/l Lactobacillus plantarum subsp. plantarum 164.1±8.12 unit/l. Conclusion : The result that the β-glucosidase activity was higher in P. pentosaceus, L. mesenteroide, and L. plantarum subsp. plantarum as compared to tested microbes. Therefore selected bacteria can be used in the industry of functioned foods and beverage to improve human healths.

상황버섯을 90℃에서 환류추출 시 시간과 추출용매의 조건(물 및 에탄올 농도, pH)에 따른 추출물을 제조하여 β-glucan 함량과 항산화활성 및 항산화성분의 함량을 조사 하였다. 상황버섯 추출물은 추출시간이 길어짐에 따라 수 율과 β-glucan 함량이 증가하여 24시간 추출 조건을 실험에 사용하였다. 추출용매에 따른 상황버섯 추출물의 수율은 60% 에탄올, pH 4의 조건에서 가장 높았다. β-glucan 함량 은 열수 추출물에서 높은 함량을 나타내었고, 산성과 중성 조건에서 높게 나타났다. 항산화활성은 60% 에탄올, pH 7 조건에서 추출한 것이 가장 높았다. 항산화성분의 함량 또한 항산화활성과 같은 경향을 보였으며, 수율, β-glucan 함량, 항산화활성 및 성분을 모두 고려하였을 때 60% 에탄 올, pH 7 추출 조건이 적합하였다.

The β-carotene biofortified transgenic soybean was developed recently through Agrobacterium -mediated transformation using the recombinant PAC (Phytoene synthase-2A-Carotene desaturase) gene in Korean soybean (Glycine max L. cv. Kwangan). GM crops prior to use as food or release into the environment required risk assessments to environment and human health in Korea. Generally, transgenic plants containing a copy of T-DNA were used for stable expression of desirable trait gene in risk assessments. Also, information about integration site of T-DNA can be used to test the hypothesis that the inserted DNA does not trigger production of unintended transgenic proteins, or disrupt plant genes, which may cause the transgenic crop to be harmful. As these reasons, we selected four transgenic soybean lines expressing carotenoid biosynthesis genes with a copy of T-DNA by using Southern blot analysis, and analyzed the integration sites of their T-DNA by using flanking sequence analysis. The results showed that, T-DNA of three transgenic soybean lines (7-1-1-1, 9-1-2, 10-10-1) was inserted within intergenic region of the soybean chromosome, while T-DNA of a transgenic soybean line (10-19-1) located exon region of chromosome 13. This data of integration site and flanking sequences is useful for the biosafety assessment and for the identification of the β-carotene biofortified transgenic soybean.

The β-carotene biofortified transgenic rice was developed by transforming rice cv. Nakdongbyeo with phytoene synthase (Psy) and carotene desaturase (Crt I) genes isolated from Capsicum and Pantoea. The aim of this study was to perform molecular characterization of rice transformants of T5-T7 generation harboring Psy and Ctr I genes driven by endosperm specific globulin promoter for biosafety evaluation of β-carotene biofortified transgenic rice. The structure and sequence of T-DNA in the transformation vector and the insertion sites, flanking sequences and generational stability of inserted T-DNA in transgenic rice lines were analyzed. The transformation vector consisted of right border, MAR gene, carotenogenic genes unit, herbicide resistance selectable marker unit, MAR gene and left border in sequential order. T-DNA was introduced at the position of 30,363,938-30,363,973 bp of chromosome No. 2 by adaptor-ligation PCR. Stable integration of T-DNA and stable expression of bar gene was confirmed in T5 to T7 generations. It was also confirmed that the backbone DNA of transformation vector containing antibacterial gene was not present in the genome of β-carotene biofortified transgenic rice. HPLC analysis confirmed that carotenoids were consistently detected through T5-T7 generations.

한국형 잔디는 다른 병에 비해 진전 속도가 빠르고 주로 뿌리에서부터 발병하여 잔디를 고사시키고 발병 후 구제하기 매우 어려운 라이족토니아잎마름병(라지패취)이 큰 문제로 대두되고 있다. 라이족토니아잎마름병(라지패취)은 Rhizoctonia solani AG2-2(Ⅳ)병원균에 의해 발생하는데, 이 병원균에 강한 내병성 들잔디를 개발하기 위해 식물방어반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 PR-Protein 중 하나인 β-1,3-glucanase를 들잔디로부터 cloning 하였다. β-1,3-glucanase는 바이러스나 균의 감염으로 인해 식물조직이 과민반응을 일으킬 때 세포내에서 생성되고 세포외로 분비되어 세포 사이 공간에서 주로 기능을 하는 것으로 알려져 있다. β-1,3-glucanase의 기능분석이 되어있는 단자엽식물 중 옥수수, 밀, 보리, 벼의 염기서열에서 공통으로 보존되어 있는 부분을 이용해 degenerate PCR을 수행하고 얻어낸 sequence를 통해 3` RACE와 5` RACE를 진행하였다. 그 결과 1,228 bp, 399개의 아미노산으로 구성된 ZJGlu1과 1,179 bp, 340개의 아미노산으로 구성된 ZJGlu2의 Full-sequence 얻어냈다. ZJGlu1과 ZJGlu2와의 염기서열 상동성은 76%이며, ZJGlu1의 경우 VISESGWPSAG서열을 보존하고 있고 ZJGlu2의 경우 VSESGWPSA서열을 보존하고 있어 glycosyl hydrolase motif(LGIVISESGWPSAG)와 비교해 봤을 때 상당부분 일치하는 것을 보였다. ZJGlu1과 ZJGlu2 유전자의 기능을 해석하기 위해 각각의 유전자를 도입한 식물형질전환용 벡터를 제작하여 모델식물인 애기장대와 잔디 형질 전환체는 현재 진행 중에 있으며, E.coli over-expression을 수행하여 목표 단백질을 정제하고 in vitro 활성을 측정할 예정이다.

The β-carotene biofortified transgenic soybean was developed recently through Agrobacterium-mediated transformation using the recombinant PAC (Phytoene synthase-2A-Carotene desaturase) gene in Korean soybean (Glycine max L. cv. Kwangan). GM crops prior to use as food or release into the environment required risk assessments to environment and human health in Korea. Generally, transgenic plants containing a copy of T-DNA were used for stable expression of desirable trait gene in risk assessments. Also, information about integration site of T-DNA can be used to test the hypothesis that the inserted DNA does not trigger production of unintended transgenic proteins, or disrupt plant genes, which may cause the transgenic crop to be harmful. As these reasons, we selected four transgenic soybean lines expressing carotenoid biosynthesis genes with a copy of T-DNA by using Southern blot analysis, and analyzed the integration sites of their T-DNA by using flanking sequence analysis. The results showed that, T-DNA of three transgenic soybean lines (7-1-1-1, 9-1-2, 10-10-1) was inserted within intergenic region of the soybean chromosome, while T-DNA of a transgenic soybean line (10-19-1) located exon region of chromosome 13. This data of integration site and flanking sequences is useful for the biosafety assessment and for the identification of the β-carotene biofortified transgenic soybean.

β-카로틴 강화벼 도입유전자의 도입 위치와 안정성을 도입 위치 주변염기서열 분석과 서던 분석한 결과, 벼 염색체 2번 중 30,363,938번과 30,363,973번 사이의 단일 부위에 도입유 전가 도입되었으며, T5-T7 세대 동안 도입된 모든 유전자들 이 안정적으로 유지되고 있으며, 도입유전자의 운반체인 Backbone DNA (pSB11)는 β-카로틴 강화벼에 삽입되지 않 았음을 확인하였다. 선발 마커로 도입된 PAT 단백질의 발현 분석 결과에서도 T5-T7 세대별, 생육시기별로 안정적으로 발 현됨을 검정하였으며, 목적 형질인 β-카로틴 분석 결과에서 도 모품종인 낙동벼에 비해 9.4배 함량이 증가됨을 확인하였 다. 이상의 분석기법을 통해 복수세대에서 β-카로틴 강화벼 의 도입 유전자들이 안정적으로 유지되고 목적 단백질들이 안정적으로 발현되고 있음을 확인하였다.

황칠나무(Dendropanax mobifera Lev.)는 두릅나무과에 속하는 난대성 수종으로 대한민국 남쪽지방에 주로 분포하며 전통적인 민간요법 약재로 사용되어 왔으나 지금까지 피부에서의 효능이 잘 알려지지 않았다. 우리는 본 연구에서 황칠나무 잎의 열수추출물과 n-hexane 분획물에서 1-tetradecanol과 β-sitosterol 성분을 분리정제하여 다양한 피부개선효과와 탈모방지효과를 검증하였다. 1-tetradecanol의 타이로시나아제 활성 저해 효과는 열수추출물과 n-hexane분획물 보다 높은 저해 활성이 나타났다. 그리고 B16F10 세포를 이용한 멜라닌 양을 측정한 결과 1-tetradecanol은 세포독성 없이 농도 의존적으로 멜라닌 양이 감소됨을 확인하였다. 실험동물을 이용한 경표피수분손실량(TEWL)에서도 1-tetradecanol에서 수분 손실이 가장 낮게 나타났다. β-sitosterol의 탈모 방지에 대한 효과는 HR-1 hairless mice의 성장 주기별 특성을 이용하여 관찰하였다. 그 결과 β-sitosterol을 처리한 마우스의 탈모는 지연되었고 모발의 밀도도 가장 높게 나타났다. 그러므로 황칠 n-hexane분획물에서 분리한 1-tetradecanol과 β-sitosterol이 미백과 보습 용도의 화장품 기능성 원료 및 탈모 개선에 가능성이 있는 화장품소재로서 상업적 발전의 가능성을 보여주고 있다.

Glycogen synthase kinase-3 α/β는 Apoptosis나 cell survival, 성장인자들과 상관된 다양한 신호전달 중요한 효소이다. GSK-3는 GSK-3α와 GSK-3β인 두 개의 isoform이 존재한다. GSK-3의 아미노산 서열에서 tyrosine 214서열의 인산화, GSK-3α에서는 Serine 21번, GSK-3β에선 Serine 9번의 인산화를 통해서 신호전달기능이 조절된다. 일반적으로 GSK-3는 항상 활성화된 상태이며, 이 활성화가 억제되었을 때 신호 전달이 매개된다. 본 연구에서는 8주령의 수컷 생쥐의 정자를 대상으로 하였다. Western blot을 이용하여 GSK-3α/β, p-GSK-3α/β(tyr 214), p-GSK-3α(ser21), p-GSK-3β(ser9)의 발현을 확인하였다. 또한 면역조직화학법을 이용하여 정자 내 발현부위를 확인하였다. 정자 내 GSK-3α/β의 발현 패턴을 분석하기 위해 생쥐의 뇌, 신장, 생쥐 정소 gonocytes 세포주(GC1-SPG)를 비교 분석하였다. 뇌와 GC1-SPG 세포주에서는 GSK-3α/β는 모두 존재하는데 반해 생쥐 정자와 신장에서는 GSK-3α가 dominant하게 발현됨을 확인하였다. 정자의 수정능 획득에 의한 GSK-3α/β의 발현과 인산화의 변화를 알아보는 실험을 하였다. 부정소 미부의 정자를 추출해 배양하지 않은 정자, 수정능이 생기지 않는 Non capacitated Media (NCM)에 배양한 정자, 수정능을 얻게 하는 Human tubal fluid (HTF)에 배양한 정자들을 western blot을 통해 확인하였다. 배양을 한 정자에서 GSK-3α의 serine 억제성 인산화가 증가하였다. GSK-3α/β의 tyrosine 인산화 역시 증가하는 결과를 보였다. Capacitation에 관한 연구에선 PKA pathway가 매우 중요하다. Forskolin의 처리에 따른 Adenylic cyclase 활성화에 의해 GSK-3α/β serine 억제성 인산화가 증가하였으며, 배양을 통한 capacitation을 진행할수록 GSK-3α/β tyrosine 인산화가 증가하였다. 뿐만 아니라 cell-permeant cyclic adenosine monophosphate analog인 8-Br-cAMP(8-Bromoadenosine 3',5'-cyclic monophosphate)와 phosphodiesterase inhibitor인 IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine)를 이용해 세포내 cAMP 레벨을 증가시켜 PKA pathway 활성화하였다. 이 실험에서도 GSK-3α/β tyrosine 인산화, GSK-3α/β serine 억제성 인산화가 증가하였다. PKA 특이적으로 억제하는 H-89 dihydrochloride hydrate를 통해서도 역시 GSK-3의 억제성 인산화가 감소된 것을 볼 수 있었고 전체 적인 정자의 tyrosine 인산화 패턴이 감소된 것을 볼 수 있었다. 생쥐 부정소 정자에서는 GSK-3α가 우세한 것으로 나타났다. 생쥐 뇌와 신장에 비해서 발현양은 적게 발현된다. 이에 따라 생쥐의 정자에서는 GSK-3α의 기능이 중요하다고 사료된다. 생쥐 부정소 두부 보다 미부에서 GSK-3α/β tyrosine 인산화와 GSK-3α serine 억제성 인산화가 증가하였으므로 정자의 운동성과 수정능이 획득될수록 GSK-3α/β 신호 전달이 활성화되는 것으로 사료된다. 이번 연구를 통해 GSK-3α/β는 PKA pathway dependent한 요소로서 기능하며 포유류 정자 내부의 운동성과 수정능에 대한 신호조절 체계 이해에 필요한 것으로 사료된다.

The present study investigated an ethanol extract (SSB) of a mixture of three medicinal plants of Vitisamurensis, Aralia cordata, and Glycyrrhizae radix for possible neuroprotective effects on neurotoxicity induced byAmyloid β protein (Aβ) (25-35) in cultured rat cortical neurons and antidementia activity in mice. Exposure of cultured cor-tical neurons to 15μM Aβ (25-35) for 36h induced neuronal apoptotic death. At 1-30㎍/㎖, SSB inhibited neuronal death,elevation of intracellular calcium concentration ([Ca²+]i), and generation of reactive oxygen species (ROS) induced by Aβ(25-35) in cultured cortical neurons. Memory impairment and increase of acetylcholinesterase activity induced by intra-cerebroventricular injection of mice with 16nmol Aβ (25-35) was inhibited by chronic treatment with SSB (25, 50 and100㎎/㎏, p.o., for 8 days). From these results, it is suggested that antidementia effect of SSB is due to its neuroprotectiveeffect against Aβ (25-35)-induced neurotoxicity and that SSB may have a therapeutic role in preventing the progression ofAlzheimer’s disease.

본 연구에서는 두충 추출물이 RBL-2H3 세포의 β-hexosaminidase의 분비 억제와 HaCaT keratinocytes피부장벽의 회복과 관련한 filaggrin, transglutaminase-1 (TGase-1), cornified cell envelope(CE)의 발현에 미치는 영향에 관하여 연구하였다. β-hexosaminidase 방출 억제 능은 13% 효능을 확인하였고, 피부장벽기능의 회복과 관련된 인자들은 발현과 활성의 정도가 매우 우수한 것을 확인하였다. 각질형성세포의 분화를 판단할 수 있는 CE 측정에서는 두충추출물이 양성대조군보다 더 좋은 효능을 나타내기도 하였다. 따라서 두충 추출물은 β-hexosaminidase 분비 억제에 효과가 있으며, 손상된 피부장벽강화에 영향을 미치는각질형성세포의 분화 촉진에 효과가 있음을 확인하였다.

Transforming growth factor (TGF) family is well known to induce the chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells (MSC). However, the precise signal transduction pathways and underlying factors are not well known. Thus the present study aims to evaluate the possible role of C2 domain in the chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. To this end, 145 C2 domains in the adenovirus were individually transfected to hMSC, and morphological changes were examined. Among 145 C2 domains, C2 domain of protein kinase C eta (PKCη) was selected as a possible chondrogenic differentiation factor for hMSC. To confirm this possibility, we treated TGFβ3, a well known chondrogenic differentiation factor of hMSC, and examined the increased-expression of glycosaminoglycan (GAG), collagen type II (COL II) as well as PKCη using PT-PCR, immunocytochemistry and Western blot analysis. To further evaluation of C2 domain of PKCη, we examined morphological changes, expressions of GAG and COL II after transfection of PKCη -C2 domain in hMSC. Overexpression of PKCη-C2 domain induced morphological change and increased GAG and COL II expressions. The present results demonstrate that PKCη involves in the TGF-β3-induced chondrogenic differentiation of hMSC, and C2 domain of PKCη has important role in this process.

본 연구에서는 도라지 추출물에 대한 세포 독성을 확인하였으며, Aβ에 의한 PC12 세포 독성에 대한 보호효과를 관찰하였다. 또한 도라지 추출물과 도라지 추출물 연양갱을 4주간 강제 경구 투여하여 Morris 수중미로시험에서 도달지점까지의 도달시간이 도라지 추출물 및 도라지 추출물 연양갱 투여에 의해서 모두에서 유의하게 감소하였다. 이와 유사하게 수동회피시험에서도 자극이 있는 어두운 방을 나오는 시간이 도라지 추출물 및 도라지 추출물 연양갱 투여에 의해서 현저하게 감소하였다. 따라서 도라지 추출물 및 도라지 추출물 연양갱은 인지능 개선에 도움을 줄 것으로 생각된다.