완두에 있어서 보다 효율적인 형질전환 방법을 모색하고 형질전환된 개체를 얻고자 본 실험을 수행하여 얻어진 결과는 다음과 같다. 형질전환은 발아중인 완두의 생장점(shoot tip)을 제거한 다음 T-DNA내에 GUS gene과 neomycin phosphotransferase II gene이 들어있는 binary vector를 가진 Agrobacterium tumefaciens를 생장점을 제거한 부위에 감염시켰다. 감염 후 새로 형성된 shoot는 개체당 4~5개였으며, 그중 GUS유전자가 발현하는 shoot만을 정상적인 식물체로 분화 시켰다. 감염부위에서 형성된 shoot에서의 GUS유전자의 발현빈도는 10%내외였다. 이들 개체로 부터 genomic DNA를 분리하여 Dot blot hybridization분석 결과 T-DNA가 식물체 내에 존재함을 알 수 있었고, 수확한 종자를 발아시켜 Sorthern blot hybridization한 결과 T-DNA가 다음세대로 전달되었음이 확인되었으며 형질전환율은 2%이내였다.

본 연구에 사용한 시료는 형성층 유래의 캘러스를 0.01mg/ 2, 4-D, 0.5mg/ BAP, 3% sucrose, 0.75% 한천을 첨가한 MS배지에서 재분화 시킨 개체를 이용하였다. 시료의 대량증식은 1.0mg/ BAP를 첨가한 MS 배지에서 실시하였으며 엽전개는 식물생장조절제가 첨가되지 않은 MS배지로 옮겨서 실행하였다. Agrobacteria를 이용한 형질 전환은 엽절편, 절간조직등을 박테리아를 묻힌 침으로 자극하여 식물체 분화를 유도하였다. 그 결과 엽절편 조직에서는 분화된 식물체를 얻지 못했으나, 절간조직의 측아에서는 49%에 달하는 24개체가 분화되었다. 이들 분화된 줄기는 kanamycin이 100mg/이 함유된 선발 배지에서 일차적인 선발을 하여 최종적으로 GUS 유전자 검정을 한 결과 처음에 접종한 50개체중 형질전환 된 것으로 추정되는 5개체를 얻어서 형질 전환 추정 비율은 10%에 달한 것으로 나타났다.

The optimum conditions and mechanisms for the plasmid-mediated genetic transformation of intact cells of Bacillus brevis P176-2, an extracellular protein producing bacterium, by electroporation were investigated. It was found that pUB110 plasmid DNA can be introduced into intact bacterial cells by electroporation. The frequency of transformation by this electroporation system depended upon the initial electric field strength, the capacity of the electric discharge capacitor, growth stage, number of successive pulses and composition of electroporation buffer. It was effective for transformation that cells were harvested, washed and resuspended with HSM [7mM HEPES(pH 7.4), 272mM sucrose, 1mM MgCl_2] electroporation buffer when cell growth was attained to 1.2 at OD_660. A maximum frequency of transformation of 2.40×10 exp (4) transformants per ㎍ plasmid DNA was obtained by two succesive pulses with an initial electric field strength of 12.5㎸/㎝ and with a capacitance of 7.3㎌.

효모(酵母)와 대장균(大腸菌)의 셔틀 벡터인 YIp5, YRp7, YEp13플라스미드를 S. cerevisiae DBY747을 수용세포(受容細胞)로 하여 원형질체 방법(方法)에 의해 형질전환(形質轉換)시킨 결과(結果), YIp5플라스미드는 형질전환체가 나타나지 않았으며, YEp13플라스미드는 DNA 당(當) , YRp7은 개(個)의 형질전환체를 얻었다. YIp5플라스미드와 YEp13플라스미드, 그리고 YIp5플라스미드와 YRp7플라스미드를 환상(環狀)플라스미드 상태(狀態)로 동시형질전환(同時形質轉換) 시켰을 때 각각 DNA 당(當) 210 및 95개(個)의 형질전환체를 얻었으며, 동일(同一) 부위(部位) 또는 다른 부위(部位)를 절단(切斷)한 선상(線狀)플라스크를 앞서와 같이 동시형질전환(同時形質轉換)시켰을때, 서로 비슷하게 DNA 당(當) 15~85개(個)의 형질전환체를 얻을 수 있었다. 이러한 결과(結果)에서 볼때 수용세포(受容細胞)를 S. cerevisiae DBY747로한 동시형질전환(同時形質轉換)에서 환상(環狀)플라스미드간(間)의 형질전환(形質轉換)이 선상(線狀)플라스미드간(間)의 형질전환(形質轉換)보다 빈도(頻度)가 높으며 선상(線狀)플라스미드간(間)의 형질전환(形質轉換)에서 미단(未端) 부위(部位)의 상이(相異)함이 큰 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. 형질전환체의 안정성(安定性)에 있어서는 YIp5플라스미드와 YEp13플라스미드간(間)의 형질전환체가 YIp5플라스미드와 YRp7플라스미드간(間) 형질전환체에 비(比)해 안정(安定)하게 나타났는데, 이는 stringent control을 받는 ARS유전자(遺傳子)를 가진 YRp7플라스미드보다 DNA 복제(複製) 기점(起點)을 가진 YEp13플라스미드의 복제수(copy number)가 많기 때문인 것으로 생각된다.

Background : Miscanthus sinensis is a diploid hybrid and a temperate, perennial, cross-pollinating grass used as bioenergy plant, biomass production and high quality cellulose and ethanol production. This study was to carried out to investigate the expression of MsCOMT gene and the variation of lignocellulosic component and phenolic compounds contents in transgenic plants. Methods and Results : Multiple bands were detected from the homologous region of the COMT gene in PCR analysis. In order to obtain more detailed results, putative transgenic lines were estimated by RT-PCR analysis to confirm the expression of mRNA. Also, analysis of the lignin, cellulose, hemicellulose, and phenolic compound contents of transgenic Miscanthus plants were performed. Total lignin content of transgenic plants was lower than that of the control plant due to reduced caffeic acid O-methyltransferase (COMT) gene expression related to lignin production. Cellulose and hemicellulose contents in transgenic plants were not increased. Variation in cellulose and hemicellulose contents had no correlation with variation in lignin content of transgenic plants. Conclusion : In conclusion, transgenic M. sinensis was obtained with down-regulated COMT gene. Lignin synthesis was decreased what offers possibility of crop modification for facilitated biofuel production.

Plant molecular farming has attracted a lot of attention lately in the field of mass production of industrially valuable materials by extending application of the plant as a kind of factory concept. Among them, protein expression system using rice(Oryza sativa L.) callus is a technology capable of mass culture and industrialization because of a high expression rate of a target protein. This study was carried out to develop an Agrobacterium-mediated transformation system to increase the utilization of rice callus. The transformation efficiency was improved by using the hand when seeds were de-husked for callus induction. Furthermore, we were possible induction of callus from 6 years old seed smoothly. Selection of the callus contained the target gene was required a cultivation period of at least 3 weeks, and the most efficient selection period was after 6 weeks of culture including one passage. This selection was confirmed that the gene was stably inserted into the genomic DNA of the plant cell by the southern blot analysis and progeny test. Such an efficient selection system of rice callus that can be cultured in the long term will be contribute to the industrialization of useful recombinant proteins using rice.

Antigen production in plant is a safe and effective strategy for vaccine development. In this study, rice transformants were developed for oral vaccine against pigs diarrhea disease. DNA cassette composed with the cholera toxin subunit B (CTB) connected to the 987P-fasG, for stimulating a strong oral immune response, was introduced to rice through Agrobacterium mediated genetic transformation. Copy number analysis by TaqMan real-time PCR for transgenes revealed that transgene of 1 to 8 copies have been introduced into T1 and T2 rice seeds. The expression level of mRNA in the transformants T1 and T2 generations were up to 35 times higher than the reference value in the result of analysis by Quantitative real time-PCR. In addition, the callus cultured from rice transformants was confirmed that the introduced gene has been maintained till 9-month subculture duration. The amount of mRNA expression value was also confirmed in callus, which was maintained above 2.6 times compared with that of the standard control for a long time. These results provide that the introduced antigen for plant-based vaccine against bacterial diarrhea disease can be maintained in the callus as well as in the transgenic plant and suggest that the callus culture of plant transformant will be an effective way to obtain a plant-derived edible vaccine.

Background : Temperature is major factor for growth plant. Recently, because of global warming, abnormal temperature included drought, deluge, sudden temperature change and heavy snow damaged crops in the world. In Korea, crops have been sensitive to low temperature on early growth stage, e.g. fruit tree and ginseng, were damaged owing to sudden heavy snow and cold on Spring. Therefore, recently interest in cold resistance crops were increased in demand rapidly. This study was performed to establish transgenic Nicotiana benthamiana by transforming cold resistant gene related to cold tolerance S-adenosylmethionine synthetase (SAMS) isolated from Miscanthus sinensis. Methods and Results : Total RNA was extracted from leaves of M. sinensis using Trizol assay and isolated MsSAMS. Isolated MsSAMS was insert into SacⅠ- XbaⅠ sites of pMBP1 vector. The vector was transformed to Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 by DH5α. A. tumefaciens with binary plasmid were selected at YEP medium supplemented with kanamycin. Cut leaves of tobacco were co-cultured with selected A. tumefaciens. Co-cultured leaves was grown on regeneration medium for a month at dark condition, and transferred to at light condition. Regeneration shoot from callus were excised and transferred to root-induction medium. Approximately, 58% of leaves explant produced callus. Nearly, 30% of callus had shoot and approximately, 94% of shoots were rooted in root-induction medium. Conclusion : We established an efficient transformation system of N. benthamiana transformed by using MsSAMS gene related to cold tolerance isolated from M. sinensis. We may use the produced transgenic plants to prevent damages carried by cold.

Background : Miscanthus is a diploid hybrid and a temperate, perennial, cross-pollinating grass used as bioenergy plant, biomass production and high quality cellulose and ethanol production. This study was to determine an efficient transformation system for Miscanthus sinensis, and to optimize factors and conditions required for expression of MsCOMT–AS gene. Methods and Results : An efficient transformation of callus from M. sinensis was established using Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 harboring a binary vector pMBP1. In order to establish stable transformation system, we obtained high transformation rate from callus by various transformation factor explant type, strain, co-culture periods, acetosyringone concentration, and selective marker. Finally, in this study, seven putative transgenic plants were obtained. Through various tests including PCR analysis and southern blot were to detect antisense of COMT digested Xba I and Sac I restriction enzymes. The biomass of the control plant was superior than transgenic plants. Conclusion : This study was to develop transgenic Miscanthus sinensis by Agrobacterium tumerfeciens mediated transformation to produce high bioethanols and to reduce the lignin content of transgenic plants. Detailed characterization of the transgenic plants revealed interesting finding about COMT gene expression in the segregates

Leaf water and osmotic potential, chlorophyll content, photosynthetic rate, and electrolyte leakage were measured to evaluate tolerance to water stress in wild-type (WT) and transgenic tobacco plants (TR) expressing copper/zink superoxide dismutase (CuZnSOD) and ascorbate peroxidase (APX) in chloroplasts. Leaf water potential of both WT and TR plants decreased similarly under water stress condition. However, leaf osmotic potential of TR plants more negatively decreased in the process of dehydration, compared with WT plants, suggesting osmotic adjustment. Stomatal conductance (Gs) in WT plants markedly decreased from the Day 4 after withholding water, while that in TR plants retained relatively high values. Relatively low chlorophyll content and photosynthetic rate under water stress were shown in WT plants since 4th day after treatment. In particular, damage indicated by electrolyte leakage during water stress was higher in WT plants than in TR plants. On the other hand, SOD and APX activity was remarkably higher in TR plants. These results indicate that transgenic tobacco plants expressing copper/zink superoxide dismutase (CuZnSOD) and ascorbate peroxidase (APX) in chloroplasts improve tolerance to water stress.

고추에서는 역병, 탄저병, 바이러스병 등이 큰 피해를 주고 있기 때문에 내병성 및 고품질계 고추 품종 육성의 중요성이 지속적으로 증가하는 상황이다. 때문에 현재 개개의 분자표지를 한번에 1개씩 분석하는 시스템에서 다수의 분자표지로 고추의 유전자형을 빠르고 정확하게 분석할 수 있는 시스템 개발이 절실히 필요하다. 본 연구에서는 Fluidigm 192.24chip을 이용하여 192개의 고추 개체에 대해 24개의 SNP 분자표지를 한 번에 분석하고자 하였다. 이 방법은 한 번의 실험을 통해 4,608개의 data points를 얻을 수 있다. 이를 위해 본 연구에서는 기 개발된 STS 또는 HRM 분자표지를 대량분석이 가능한 Fluidigm용 SNP 분자표지로 전환하고자 하였으며, 총 191개의 고추 샘플과 24개의 내병성 및 웅성불임 분자표지를 이용하여 실험하였다. 실험에 이용된 분자표지는 세균반점병 저항성, 탄저병 저항성, CMV 저항성, 웅성불임성, TMV 저항성, 역병 저항성, CMS 회복유전자, Potyvirus 저항성, TSWV 저항성 분자표지로서 총 24개를 Fluidigm용 SNP 분자표지로 디자인하였다. 식물재료로는 JN F5 분리집단 96점과 고추 유전자원 91점, GMSK F2 분리집단 4점 등 총 191점의 식물샘플을 이용하였고, 나머지 하나는 음성대조군으로 사용하였다. 192.24chip을 분석한 결과 24개의 분자표지 중 19개의 분자표지가 다형성이 구분되는 것으로 판단되었다. 각각의 분자표지에 대한 정확성을 판단하기 위해 기존의 STS 또는 HRM 분자표지의 분석 결과와 비교하였다. 본 연구를 통해 고추의 유용 형질과 연관된 foreground selection용 multiplexing 분자표지를 개발함으로써 신속하고 저렴하게 분자표지를 동시에 분석할 수 있는 기술을 확보할 수 있을 것으로 기대된다.

팔레놉시스는 최근 심비디움과 더불어 주요 수출화훼작물로 자리잡고 있으며, 국내 화훼시장에서 중요성이 증대되고 소비자들로부터 많은 인기를 받고 있는 실정이다. 이에 반해 국내 팔레놉시스 우량묘 생산체계는 대만, 네덜란드 및 일본 등 난 생산 선진국들과 비교해서 변이발생 및 우량형질 유지 측면에서 부족한 점이 많으며 최근 화훼류 신품종 육성에 많이 도입되고 있는 식물형질전환 기술을 이용한 사례도 국내에는 거의 없는 실정이다. 본 연구는 노화지연 유전자가 삽입된 팔레놉시스 형질전환 식물체의 원괴체유사체 (PLB: protocorm-like bodies)의 증식 및 신초 재분화에 있어서 다양한 천연산물 처리가 어떠한 효과를 나타내는지 구명하고자 실시하였다. 팔레놉시스 조직배양 및 형질전환 유래 식물체들은 banana powder, apple powder 및 potato powder 이 3가지 천연 산물들을 VW배지에 1, 5, 10, 20, 30, 40 그리고 50 g/l 농도로 각각 첨가하여 생체중 측정 및 신초 분화효율을 측정하여 최적의 형질전환 팔레놉시스 PLB 대량증식 체계를 확립하고자 하였다. 그 결과 apple powder 30 g/l 및 banana powder 40 g/l을 혼용한 처리구에서 PLB 생체중이 대조구 대비 2.2배 이상 증가하여 처리구 중 가장 좋은 결과를 보였으며, 또한 PLB로부터 신초 발생율도 80-85%의 고효율을 나타내었다. 그리고 PLB 조직의 갈변율도 3% 미만으로 양호한 결과를 보여 주었다. 또한 이 두 천연산물의 조합은 형질전환 팔레놉시스 PLB 뿐만 아니라 조직배양 유래 팔레놉시스 PLB 생장과 증식에도 유사한 효과를 나타내었다. 이러한 천연산물의 적절한 첨가는 향후 형질전환 팔레놉시스 식물체 대량증식 체계 확립에 기여할 수 있을 것이다.

한국들잔디(Korean Lawngrass, Zoysia japonica Steud.)는 한국잔디류 중 답압성, 내한성, 내서성이 가장 강하며, 관리가 용이하여 정원, 공원, 묘지, 경사면 녹화 등에 폭넓게 이용되고 있다.최근 잔디의 이용범위가 확대되면서 다양한 용도의 잔디 품종 개발이 요구되고 있어 개량할 수 있는 형질이 제한되어 있는 전통육종법 대신 분자육종에 의한 신품종 개발이 활발하게 진행되고 있다. 본 연구에서는 건조, 산화스트레스 내성, 노화지연 등의 형질을 제공하는것으로 알려진 애기장대 유래의 ATPG10 (AT-hook protein of Genomine 10)유전자를 Agrobacterium 형질전환방법을 이용하여 도입시켰다. Agrobacterium 배양액을 최종 O.D.600 값이 0.1이 될 때까지 현탁하여 재분화가 잘되는 형태의 캘러스를 24시간 감염, 3일간 공동배양, PPT 항생제가 첨가된 선발배지에서 신초유도 및 선발, 2~3cm 이상 성장한 shoot를 뿌리유도 및 선발과정을 거쳐 11개체의 형질전환 식물을 생산하였다. 확보된 형질전환체는 순화/증식하여 유전자의 도입 및 발현을 확인하고 기능분석을 수행하고 있다. ATPG10 유전자가 도입된 형질전환식물은 생산성 증대, 건조 스트레스 내성, 산화 스트레스 내성, 노화 지연 등의 기능을 가질것으로 기대된다.

잠재적 안전성에 대한 논란으로 인하여 신규 개발되는 유전자변형작물은 고전적인 신품종과는 달리 환경 및 식품으로서의 안전성이 검증되어야 한다. 유전자변형작물의 안전성 평가는 개발되는 형질전환집단에서 선발된 하나의 elite event에 대해 이루어지는데, 본 평가 대상 elite event는 유전자의 삽입으로 인한 비의도적인 형질 변화가 최소화된 event이어야 한다. 분자유전학적으로 비의도적인 유전자 삽입 효과가 최소화되기 위해서는 단일 복제수의 도입유전자가 식물 유전체의 intergenic region에 삽입될 것을 요구한다. 본 연구의 목적은 배추좀나방 내성을 부여하는 CryIAc1 유전자가 형질 전환된 49 event의 양배추 형질전환집단에서 elite event를 선발하는 것이다. 먼저 도입유전자 cassette이 tandem repeat로 빈번히 삽입되는 현상에 착안하여 도입유전자 cassette의 양 말단에서 제작한 primer의 방향에 따른 모든 조합을 사용하여 PCR을 수행하였다. 본 삽입구조 분석을 통하여 49개 event 중 36개 event는 tandem repeat의 구조로 도입유전자가 2개 복제 수 이상 삽입되었음을 알 수 있었다. 선발된 13개 event에 대하여 Southern blot 분석을 실시한 결과 7개 event가 단일 복제수의 도입유전자를 가짐을 알 수 있었다. 마지막으로 7개 event에 대한 삽입위치를 inverse PCR 기법을 사용하여 해명한 결과는 3개 event에서 단일 복제수의 도입유전자가 양배추 genome의 intergenic region에 삽입되었음을 알 수 있었다. 결론적으로, 본 연구 결과는 형질전환시의 도입유전자가 다중 복제수로 삽입될 시에 tandem repeat로 빈번히 삽입되는 현상에 기초하여 대량의 형질전환집단에서 elite event를 신속히 선발하는 방법을 제시하였다. 선발된 event의 분자유전학적 분석이 현재 진행되고 있다.

The β-carotene biofortified transgenic soybean was developed recently through Agrobacterium-mediated transformation using the recombinant PAC (Phytoene synthase-2A-Carotene desaturase) gene in Korean soybean (Glycine max L. cv. Kwangan). GM crops prior to use as food or release into the environment required risk assessments to environment and human health in Korea. Generally, transgenic plants containing a copy of T-DNA were used for stable expression of desirable trait gene in risk assessments. Also, information about integration site of T-DNA can be used to test the hypothesis that the inserted DNA does not trigger production of unintended transgenic proteins, or disrupt plant genes, which may cause the transgenic crop to be harmful. As these reasons, we selected four transgenic soybean lines expressing carotenoid biosynthesis genes with a copy of T-DNA by using Southern blot analysis, and analyzed the integration sites of their T-DNA by using flanking sequence analysis. The results showed that, T-DNA of three transgenic soybean lines (7-1-1-1, 9-1-2, 10-10-1) was inserted within intergenic region of the soybean chromosome, while T-DNA of a transgenic soybean line (10-19-1) located exon region of chromosome 13. This data of integration site and flanking sequences is useful for the biosafety assessment and for the identification of the β-carotene biofortified transgenic soybean.

본 연구는 Bacillus thuringiensis 유래의 살충성 mCry1Ac 유전자를 무선발 형질전환 방법으로 일미 벼에 도입하여 개 발된 마커프리 형질전환 Bt 벼 2계통의 일반성분 및 주요성분 (무기질, 아미노산) 함량을 확인하여 모본벼 및 다른 일반품 종과 함량차이를 비교 분석 함으로서 형질전환 벼의 영양성 분 동등성 여부를 확인하고자 수행되었다. 영양성분 분석결과 GM 벼 현미의 일반성분 조성 중 식이섬유 함량과 일부 무기 질 함량이 모본 벼인 일미와 비교하여 다소 유의적 차이가 있 었지만 일반품종에서 나타나는 함량범위 안에 포함되는 수치 이며, 아미노산 성분과 대부분의 일반성분 및 무기질의 함량 은 전반적으로 모본과 유의적 차이가 없었다. 따라서 형질전 환 벼에서 관찰된 일부 성분 차이는 Bt 유전자의 도입 효과가 아닌 재배 환경 및 토양성분의 차이에서 기인된 것으로 형질 전환에 의한 비의도적 영양성분 변화는 없는 것으로 판단된다.

본 연구는 내충성 독소 발현 유전자(CryIIIA)를 벼에 형질 전환하여 해충에 대한 저항성을 갖도록 국내에서 개발한 해충저항성 GM벼(Btt12R)와 그 모본인 낙동벼의 주요영양성분과 항영양소를 분석하여 각 성분의 함량에 차이가 있는지를 비교하기 위해서 수행하였다. 이를 위해, 낙동벼와 Btt12R 뿐만 아니라 국내 상업화 품종인 영안벼와 화성벼를 수원 GMO 격리포장에서 동일한 조건하에 재배하여 수확한 현미를 사용하였다. 47가지 주요영양성분(8가지 일반성분, 17가지 아미노산, 8가지 지방산, 9가지 미네랄, 5가지 비타민) 중에 16가지 성분의 함량이 모본과 Btt12R 간에 차이를 보였지만, Btt12R의 이 16가지 성분은 함께 재배한 일반벼와 OECD에 명기된 함량 범위 내에 있었다. 2가지 항영양소 중 트립신 저해제는 모든 시료에 0.1 TIU/mg 미만의 극미량으로 존재했으며, Btt12R의 피트산 함량은 낙동벼와 일반벼의 피트산 범위에 포함되었다. 이상의 결과를 종합해보면, 분석한 Btt12R의 모든 주요영양성분 및 항영소의 함량이 모본 및 상업화 품종의 함량 범위에 포함되었으며, 이를 통해 CryIIIA 유전자를 벼 게놈에 삽입하는 것이 현미의 영양학적 품질에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.

고세대 형질전환 벼 계통인 가뭄저항성 벼(CaMsrB2), 레스베라트롤 합성벼(RS), 인산 이용성 증진 벼(OsPT7) 3계 통과 모품종인 일미벼와 동진벼, 그리고 비교 품종으로 화성벼와 남평벼를 이용하여 수원, 익산과 밀양의 3개 지역 GMO 격리 포장에서 표준재배 시험으로 농업형질을 평가하였다. 가뭄저항성 벼 계통(CaMsrB2)은 익산에서 출수 기가 모품종 대비 1일 정도 늦었으며 라스베라트롤 합성벼(RS)는 수원, 익산, 밀양에서 모품종과 비교하여 4~5일 늦고. 인산 이용성 증진 벼(OsPT7 ) 계통은 익산지역에서 모품종 대비 1일정도 늦게 출수되었다. 형질전환 3계통의 수량성은 3개 지역에서 모품종 대비 수량지수가 88~102 였으며 수원과 익산에서 3계통은 모품종과 수량차이가 없 었으나 밀양에서 가뭄저항성 벼 계통과 인산이용성 증진 벼 계통은 모품종 보다 수량이 낮은 것으로 나타났다. 형 질전환 3계통은 모품종과 생육비교에서 출수기, 등숙비율, 천립중, 수량성과 지역 적응성에 차이가 있는 것으로 평가 되었다.